[发明专利]基因测序仪的短接头、双index接头引物和双index建库体系

说明书

本发明提供的一种基因测序仪的短接头、双index接头引物和双index建库体系，短接头包括两条部分互补的接头寡核苷酸链：接头寡核苷酸链1，由5’端到3’端依次包括index2引物结合区、正义接头互补区、正义分子标签和1个突出的碱基T；接头寡核苷酸链2，由5’端到3’端依次包括反义分子标签、反义接头互补区和index1引物结合区。使用上述短接头构建的双index文库体系的片段转化效率、index组合间扩增效率均一性、捕获效率均一性以及数据产量稳定性方面均显著优于现有的双index文库体系。

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，具体涉及一种基因测序仪的短接头、双index接头引物和双index建库体系以及应用。

背景技术

二代测序技术(NGS)的发展，大大提高了测序速度和测序通量。华大智造推出的DNBSEQ-T7，单日数据产量可达6Tb，是十年前Genome Analyzer的6000倍。如此巨大通量的提升，使得更多的样本可以在同一个Run 中同时测序。目前解决样本混合测序的策略，是在不同样本的DNA片段上引入样本特异的条形码序列(index)。通过识别index序列信息，实现单样本数据的拆分。2017年Illumina发布白皮书指出，在大规模混合测序中，排他性扩增、index测序错误以及残留的引物、接头在多文库混合杂交后PCR 中引入的嵌合体文库是导致标签跳跃(index hopping)的主要原因。推荐使用双index策略减少因上述原因造成的标签识别错误。

Gene⁺Seq2000平台在测序芯片外通过滚环扩增(RCA)进行文库信号放大，使其从原理上避免了排他性扩增带来的index hopping，降低了样本间串扰，从而提高了低频变异检测灵敏度和特异性。通过增加index间的编辑距离，消除了index测序错误导致的index交叉污染。目前现有的单index文库体系已被证实存在index hopping的风险。基于此，本公司进行了接头引物优化，独创性的对该文库结构进行优化。对比实验结果显示，优化后的吉因加特异双端index文库体系片段转化效率、index组合间扩增效率均一性、捕获效率均一性以及数据产量稳定性方面均显著优于现有双index文库体系。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的双端index接头建库体系存在片段转化效率低，index组合间扩增效率均一性差、捕获效率均一性差以及测序数据产量不稳定的缺陷。从而提供一种短接头、双index 接头引物、双index建库体系以及应用。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

第一方面，本发明提供了一种短接头，包括两条部分互补的接头寡核苷酸链：

接头寡核苷酸链1，由5’端到3’端依次包括index2引物结合区、正义接头互补区、正义分子标签和1个突出的碱基T；所述index2引物结合区的长度为15-42bp，所述正义接头互补区长度为8bp，所述正义分子标签的长度为2-10bp；所述正义接头互补区全部或部分与index2引物结合区的3’末端序列重合；

接头寡核苷酸链2，由5’端到3’端依次包括与接头寡核苷酸链1中的正义分子标签反向互补的反义分子标签、与接头寡核苷酸链1正义接头互补区反向互补的反义接头互补区和index1引物结合区；所述反义分子标签长度为2-10bp，所述反义接头互补区长度为8bp，所述index1引物结合区长度为15-30bp；所述反义接头互补区全部或部分与index1引物结合区的5’末端序列重合。

在所述的短接头中，接头寡核苷酸链2的5’端磷酸化修饰；优选的，所述短接头为Y型短接头。

第二方面，本发明提供了一种双index接头引物，包括正向接头引物和反向接头引物；

正向接头引物，由5’端到3’端依次包括GF引物序列、index2序列和 index2引物结合区序列；