[发明专利]一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法

说明书

本发明公开了一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，涉及分子生物技术领域，具体地，该用于识别蛋白质磷酸化位点的方法包括将表达载体1表达的蛋白通过免疫沉淀实验分离，使用磷酸化抗体进行免疫印迹实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况，表达载体1含具有待测位点的氨基酸序列片段，其在没有针对单个蛋白位点的磷酸化抗体的条件下，也能够有效准确地检测蛋白单个位点的磷酸化修饰情况，节省了针对特定位点的磷酸化抗体的制备成本，加快蛋白质磷酸化位点的研究进程。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体而言，涉及一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法。

背景技术

蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程调节着细胞信号转导、细胞代谢、细胞分化和细胞生长等重要的生命活动过程，是细胞生理活动的分子开关。不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点，其增加了磷酸化蛋白质研究的复杂性，使磷酸化蛋白质成为蛋白质翻译后修饰研究的热点。

用³²P选择性标记磷酸化蛋白是一种经典的技术，其通过纯化的激酶及³²P进行体外标记，或利用³²P-ATP或³²PO₄^3-(正磷酸盐)进行体内标记，然后通过SDS-PAGE、2D-GE或薄层层析对蛋白质进行分离，再经放射自显影或光学成像检测标记的磷酸化蛋白。

体外检测到的磷酸化蛋白是否具有生物学意义，必须对它在体内的磷酸化情况进行验证。因为在体外情况下，激酶可能会与许多在生理条件下因处于不同的细胞或亚细胞结构而根本无法接触到的蛋白质发生作用，从而得出假阳性结沦。

而体内磷酸化标记研究也取决于机体本身磷酸化的效率，及靶蛋白磷酸化与非磷酸化形态之间的平衡关系。如果某一蛋白已经被磷酸基团所饱和，那么无论激酶的活性如何，也不会有放射件标记的磷酸基团插人，因此也检测不到磷酸化蛋白。

到了20世纪90年代。磷酸化位点分析的标准途径是用³²P标记纯化的磷酸化蛋白，通过一维的薄层电泳和二维的薄层层析(称为二维肽谱)对所得到的肽段进行分离，放射自显影检测磷酸化肽段，进行埃德曼降解测序；或使用荧光标记磷酸肽.然后通过磷酸化残基特定的滞留时间、荧光标记或放射性标记的氨基酸的释放最终定位磷酸化位点释放的氨基酸进行鉴定，而该方法进行大规模应用时，工作量显然太大。

随着蛋白质组学技术的不断发展，蛋白质组学研究已经进入定量分析及功能蛋白质组阶段，磷酸化修饰成为众多学者关注的重点。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法。

本发明是这样实现的：

实施例提供一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其包括以下步骤：将表达载体1表达的蛋白通过免疫沉淀实验分离，使用磷酸化抗体进行免疫印迹实验以检测待测磷酸化位点的修饰情况，表达载体1含具有待测位点的氨基酸序列片段1；

氨基酸序列片段1为待测蛋白的片段上除待测位点外大部分可能的可逆磷酸化位点均进行永久非磷酸化位点突变的片段。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供了一种用于识别蛋白质磷酸化位点的方法，其在没有针对单个蛋白位点的磷酸化抗体的条件下，也能够有效准确地检测蛋白单个位点的磷酸化修饰情况，节省了针对特定位点的磷酸化抗体的制备成本，加快蛋白质磷酸化位点的研究进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。