[发明专利]用于细胞色素P450的发酵培养基及发酵生产方法

说明书

本发明公开了一种发酵培养基，用于发酵生产细胞色素P450，包括：基础培养基，包括下列成分：包含甘油的碳源，包含蛋白胨和酵母膏的氮源和无机盐；以及补料培养基，包括下列成分：包含甘油的碳源，包含蛋白胨和酵母膏的氮源和含镁的无机盐。还公开了一种细胞色素P450的发酵生产方法，包括第一次诱导和第二次诱导，其中，在第二次诱导之前、同时和/或之后，降低发酵搅拌转速、通气量、补料速率和发酵温度中的一种或多种，从而降低生产菌体的生长代谢速率。结合本发明中的发酵培养基以及发酵生产方法，能够大幅度提高大肠杆菌发酵细胞色素P450的单位产量，大大缩短发酵周期，从而降低动力消耗和发酵成本，适宜大规模实际应用。

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种用于细胞色素P450的发酵培养基及发酵生产方法。

背景技术

细胞色素P450(cytochrome P450或CYP450，简称P450)是一类以血红素为辅基的B族细胞色素超家族末端加氧酶，主要参与内源性物质和外源性物质的代谢，相对分子量约50KDa，因还原态的P450蛋白与CO结合后在450nm处呈现特征吸收峰而得名。P450是生物界中最具催化多样性的催化剂，能催化许多结构不同的物质发生羟基化、环氧化、脱烷基化、脱氨、脱氢、脱卤素等反应。

P450分布广泛，各种脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌和细菌中均已经发现它的存在，但在不同生物细胞内发挥的功能是不同的。在微生物细胞内，细胞生长所必需的初级代谢产物和一些解毒反应需要P450的参与；在植物细胞中P450参与包括生长素在内的一些化合物的生物合成，而且还可以降低除草剂的毒性；在动物细胞中的P450主要起到氧化代谢作用，包括内源性物质(脂肪酸等)的代谢作用、外源性物质(环境污染物等)的代谢作用以及一些生物活性物质的生物合成；在人体内，P450参与疾病预防等生理过程。细胞色素P450功能的多样性使其在环境、农业、工业、药品、食品等领域具有广泛的应用前景。

随着分子生物学和生物技术的发展，人们可以对P450基因进行操作，不同来源P450基因的cDNA可以在细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞等多种表达系统中表达。其中大肠杆菌是最常用的P450异源表达系统，其优点在于：1.容易操作，培养周期短、易实现规模化生产；2.表达水平相对较高；3.有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供使用；4.大肠杆菌不含P450基因，没有本底表达。但大肠杆菌作为原核表达系统也有其不可避免的缺点，例如，当表达真核细胞来源的P450时，通常需要预先对目标cDNA进行修饰(如剪切两端的非翻译区)，转译后的加工包括蛋白质折叠、蛋白质糖基化的水平过于简单等。

目前关于大肠杆菌发酵细胞色素P450的相关文献报道相对较少，且这些报道中P450的发酵基本都是在摇瓶规模上进行，多以简单且昂贵的LB或TB培养基进行发酵，尽管有一些研究者也运用了其它的一些培养基并对培养基组成和发酵工艺进行了优化，但其发酵P450的产量依旧很低，无法应用于规模化的实际生产中，如化工学报，第57卷，第5期，2006年5月，陆燕等报道用大肠杆菌发酵产P450 BM3酶活最高为0.0579U/ml，李泽莉报道用大肠杆菌发酵P450基因CYP102A16，经优化后的产量为0.43μmol/L，在Protein Expressionand Purification，2013，Susan ZelasKo等一些研究者的外文文献中所报道的P450最高产量均低于1μmol/L，且诱导时间很长，达到了48～72h。

因此，本领域技术人员致力于开发一种适合大肠杆菌高水平异源表达P450的发酵培养基和发酵方法。

发明内容

有鉴于现有技术中P450异源表达存在培养基单一、发酵周期过长、发酵成本高、酶产量低、难以规模化实际应用等技术问题，本发明旨在提供了一种适合P450异源表达的发酵培养基以及发酵方法。本发明也可以只解决上述问题中的一个或多个。

为实现上述目的，本发明提供了一种发酵生产细胞色素P450的发酵培养基，在一个具体实施方式中，该培养基包括：