[发明专利]利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种检测SARS‑CoV‑2新型冠状病毒的引物对、探针、试剂盒，所述试剂盒包含针对下述SARS‑CoV‑2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的引物对和探针：ORF1ab、S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。本发明检测SARS‑CoV‑2新型冠状病毒的试剂盒，以巢式RPA方法对SARS‑CoV‑2病毒进行核酸检测，最低可检测到1copy/ul的SARS‑CoV‑2核酸片段，具有超高灵敏度，为新冠病毒SARS‑CoV‑2的早期发现、早期隔离、早期治疗提供新的技术支撑，具有非常好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种基于巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用。

背景技术

新型冠状病毒感染性肺炎(COVID-19)的特点是潜伏期长、传染性强及死亡率高。该流行病传播迅速，造成巨大的社会危害。新冠肺炎COVID-19是由一种新型的冠状病毒SARS-CoV-2感染所致。

冠状病毒(Coronavirus,CoV)是一种包膜的单链RNA病毒，在人类、及其它哺乳动物和鸟类中广泛传播，能引起呼吸系统、肠、肝及神经系统疾病。已知有7种冠状病毒使人类致病，其中4种如Cov-229E,Cov-OC43,Cov-NL63和Cov-HKU1在人群中流行，常引起普通感冒症状。另外3种冠状病毒SARS-CoV,MERS-CoV和SARS-CoV-2具有高度的危险性，会导致严重的肺炎甚至死亡。

新冠病毒的防控措施中，早诊断、早治疗是关键。病毒核酸检测是快速诊断COVID-19 的重要手段，目前的核酸检测方法主要是荧光定量PCR(RT-qPCR)技术。

但是，基于RT-qPCR的病毒核酸检测技术，在临床应用中遇到了一些疑难问题，在中国多个城市的诸多医院中均有“假阴性”结果的报道。而且，发现有些患者经过正规治疗后两次核酸检测阴性，然而在隔离和观察14天后，他们的核酸检测结果又重新阳性。这个假阴性结果大大增加COVID-19疫情防控的复杂性。

病毒核酸检测，从患者采集样本到完成检测报告，要经历许多步骤，包括样本采集、样本保存、样本传送至检测实验室、病毒灭活、细胞溶解、核酸提取、检测并出具检测报告。其中任何步骤出现一点问题都可能导致假阴性结果。其中，高灵敏度、高特异性和高重复性的检测技术，对于提高SARS-CoV-2核酸检测质量和减少实验假阴性率至关重要。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)对DNA模板进行特异性扩增，可在接近体温条件下实现快速特异性扩增(25℃-42℃，5-30min)，作为一种等温技术减少了对高精度昂贵仪器、稳定电力供应设施及高级别实验室的依赖，只需要一个恒温装置就可完成，且可通过荧光分析装置判别是否存在扩增产物，具有对设施和操作要求均较为简单的特点，已应用于生命科学研究、医学检测、农业、食品安全、转基因检测等多个领域。

为防控COVID-19疫情蔓延，目前急需开发出具有高灵敏度和快速的新型检测技术。

发明内容

本发明要解决目前缺乏快速、准确检测SARS-CoV-2试剂盒的技术问题，提供一种基于巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒，该试剂盒具有超高灵敏度，能快速、精准、特异地对SARS-CoV-2进行检测。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种以巢式RPA检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物对，所述引物对是针对下述SARS-CoV-2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的引物对：ORF1ab、S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。