[发明专利]一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质及制备方法

权利要求书

1.一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质，其特征在于，该装甲RNA的表达载体为pET32a-CP-G2质粒，质粒包含噬菌体MS2 CP蛋白序列片段以及汉城病毒G2蛋白序列片段；汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得病毒样颗粒。

2.一种内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1、噬菌体MS2 CP蛋白基因扩增：根据噬菌体MS2 CP基因序列设计一对特异性引物CPP1和CP P2，所述引物序列如下所示：

引物CP P1：5’-GCGGTACCGGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTG-3’；

引物CP P2：5’-TTCCAGTAGCGACAGAAGCAAAAGCTTCC-3’；

以MS2噬菌体序列片段质粒为载体，使用引物CP P1和引物CP P2通过PCR扩增出MS2噬菌体基因序列MS2 CP，其序列如SEQ ID NO:3所示；

S2、表达载体pET32a-CP的获得：将PCR扩增产物和原核表达载体pET-32a用BamHI和NotI双酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段，连接后转化DH5α菌株，获得表达载体pET32a-CP；

S3、汉城病毒G2蛋白片段基因序列的获得：人工合成汉城病毒G2基因组序列，其序列如SEQ ID NO:4所示，并在序列的5’端和3’端分别插入BamHI、Not I酶切位点，酶切后连着至pBluescript II SK+质粒载体中，获得目的序列片段pBSK-G2；

S4、表达质粒pBSK-G2的获得：将pET32a-CP和pBSK-G2均使用BamHI、Not I双酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的片段，连接后转化DH5α菌株，获得汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2。

S5、汉城病毒装甲RNA获得：将汉城病毒装甲RNA表达载体pET32a-CP-G2转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得病毒样颗粒。

3.根据权利要求2所述的内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于，步骤S1中MS2噬菌体基因序列MS2 CP包括MS2噬菌体基因组5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分序列并对部分序列进行优化调整；在引物CP P1序列的5’端和引物CP P2序列的3’端分别插入Kpn I、BamHI酶切位点。

4.根据权利要求2所述的内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于，步骤S1中PCR反应体系包含以下浓度的以下组分：10X PCR Buffer 2μL、2.5mMeach的dNTP 1.6μL、5U/μL的rTaq 0.4μL、Mgcl2 1.2μL、20pmol/L的引物CP P1合伙引物CPP2 1μL、DDW 11.8μL、质粒pUC18-MS2 1μL；反应条件依次为94℃5min，94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，72℃7min。

5.根据权利要求2所述的内含汉城病毒G2蛋白基因装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于，步骤S2中酶切反应体系包含以下浓度的以下组分：10X K Buffer 1μL、15units/μL的BamHI 1μL、10units/μL的Kpn I 1μL、PCR产物和pET32a质粒1μL，DDw 16μL，37℃酶切1h；

步骤S2中连接体系包括以下浓度的以下组分：Ligation MiX 10μL、CP 8μL、pET32a 2μ，4℃过夜反应。