[发明专利]一种多黏菌素B的氨基酸构型分析方法和N-多肽端序列测序方法

权利要求书

1.一种多黏菌素B的氨基酸构型分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：采用液相色谱法从多黏菌素B混合组分中分离纯化出多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I；

S2：将纯化的所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I分别于氘代盐酸的重水溶液中加热水解，得到供试品溶液，然后分别采用手性Marfey′s试剂将对照品溶液和水解后的供试品溶液进行衍生化反应；所述Marfey′s试剂为L/D-FDAA；

S3：将步骤S2衍生化后的对照品溶液和供试品溶液，经高效液相色谱-质谱分析；

其中，液相色谱条件常规反相色谱柱；所述常规反相色谱柱为C8或C18；柱温25-40℃；检测波长为340nm；流动相A为水，含有0.01-0.2％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈或甲醇；流速为0.8-1.8mL/min，进质谱检测前分流，分流比为2:1；梯度洗脱；所述梯度洗脱的洗脱条件如下：

0min时，流动相A为73％，流动相B为27％；

5min时，流动相A为60％，流动相B为40％；

15min时，流动相A为60％，流动相B为40％；

20min时，流动相A为50％，流动相B为50％；

34min时，流动相A为50％，流动相B为50％；

36min时，流动相A为20％，流动相B为80％；

44min时，流动相A为20％，流动相B为80％；

45min时，流动相A为73％，流动相B为27％；

50min时，流动相A为73％，流动相B为27％；

质谱条件质谱离子源为ESI或APCI，扫描模式正负模式均可，质量检测器为空间/线性离子肼、飞行时间或三重四级杆质谱。

2.根据权利要求1所述多黏菌素B的氨基酸构型分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：从多黏菌素B混合组分中分离纯化出多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I；

称取多黏菌素B混合组分加入溶剂，配制成浓度为2-40mg/mL的溶液，采用液相色谱法纯化；

液相色谱条件十八烷基键合硅胶色谱柱；进样量100-1000μL；流动相A为水，含有0.01-1％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈或甲醇，流动相A:流动相B＝50:50-90:10(v/v)；流速为5-20mL/min；紫外吸收波长190-280nm；补充液为含0.01-1％甲酸的50-90％甲醇水溶液，补充液流速为0.2-0.8mL/min；

S2：将纯化的所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I分别于氘代盐酸的重水溶液中加热水解，得到供试品溶液，然后分别采用手性Marfey′s试剂将对照品溶液和水解后的供试品溶液进行衍生化反应；

S3：将步骤S2衍生化后的对照品溶液和供试品溶液，经高效液相色谱-质谱分析；

液相色谱条件常规反相色谱柱；柱温25-40℃；检测波长为340nm；流动相A为水，含有0.01-0.2％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈或甲醇；流速为0.8-1.8mL/min，进质谱检测前分流，分流比为2:1；梯度洗脱；

质谱条件质谱离子源为ESI或APCI，扫描模式正负模式均可，质量检测器为空间/线性离子肼、飞行时间或三重四级杆质谱。

3.根据权利要求2所述多黏菌素B的氨基酸构型分析方法，其特征在于，S1中，所述多黏菌素B混合组分为多黏菌素B原料药、注射剂或软膏剂；所述溶剂为水和乙腈，其体积比为水:乙腈＝50:50-90:10。

4.根据权利要求2所述多黏菌素B的氨基酸构型分析方法，其特征在于，经S1纯化得到的所述多黏菌素B1、多黏菌素B2和多黏菌素B1-I，采用HPLC-Q/TOF-MS测试其精确的分子量和纯度；

色谱条件为：流动相A为水，含有0.01-0.2％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈，含有0.01-0.2％甲酸(v/v)，流动相A:流动相B＝80:20(v/v)，柱温25-60℃，进样量2-10μL；

质谱条件为：电喷雾-单四级杆质谱的正离子扫描模式，质荷比300-1200。