[发明专利]利用ASGPR小分子配体特异性捕获肝细胞外囊泡或循环肿瘤细胞的方法

说明书

本申请公开了一种包含特异性结合人脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的小分子配体的聚合物，以及利用ASGPR结合剂，例如所述聚合物从生物体液样品中富集或分离肝组织特异性细胞外囊泡，尤其是外泌体以及肝特异性来源循环肿瘤细胞的方法。本申请还公开了ASGPR结合剂，例如所述聚合物的用途以及包含ASGPR结合剂，例如所述聚合物的试剂盒。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，本申请涉及利用ASGPR小分子配体特异性捕获肝外泌体或循环肿瘤细胞的方法。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到1000nm不等。细胞外囊泡主要由微囊泡(Microvesicles,MVs)和外泌体(Exosomes,Exs)组成，微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm–1000nm。外泌体由细胞内的多泡小体(multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为30nm-160nm。

细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。不同组织细胞来源的外泌体由于携带的蛋白质等成分不同，而能够发挥不同的生物学功能，其作为生物标志物，提供丰富，稳定，敏感和特异性的生物学信息，在体内有较长的半衰期，是具有高应用价值的液体活检标本，有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用。目前多采用超速离心、磁珠免疫捕获、沉淀或过滤的方法，对外泌体进行前期的分离，其中传统的超速离心分离需要繁琐的步骤和昂贵的仪器，这可能导致低回收率和高费用；抗体亲和法和密度梯度离心法虽可获得高纯度外泌体，但是不能获得完整状态的外泌体，无法分析外泌体完整状态下的生理功能。另一方面，广泛用于外泌体定量的标准方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹受到大样品需求和低灵敏度制约。

目前常用的免疫亲和磁珠捕获，主要以外泌体特异性标记物(如CD63)或细胞凋亡相关蛋白(如T细胞免疫前球蛋白结构域和粘蛋白结构域的蛋白4，Tim4)与磁珠结合形成固相载体，从而进行外泌体亲和捕获。该方法虽可获得纯度较高外泌体，但不具有组织特异性，在疾病的早期诊断中发挥的作用有限。

循环肿瘤细胞(CTCs)是从原发肿瘤组织脱落并侵袭进入血液循环系统中的肿瘤细胞。CTCs能够通过血液循环系统转移至其他组织上并发展为转移灶，这是导致肿瘤转移的主要途径之一。

血液中CTCs肿瘤的发生、发展和转移密切相关，因此在临床中可用于肿瘤的早期诊断，以及监测患者的疗效和复发情况。因此，实现对血液中CTCs的捕获与检测具有十分重要的生物学和临床意义。然而，CTCs在血液中含量极少，而且受血细胞等干扰极其严重，因此对CTCs检测技术的灵敏度及特异性具有极高要求。