[发明专利]一种T7RNA聚合酶和T7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法

权利要求书

1.一种用于在真核生物中表达蛋白质的T7 RNA聚合酶和T7启动子的表达系统，其特征在于，所述表达系统包含HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白，所述表达系统还包含含有携带核定位序列的vpu基因和目标蛋白基因的载体，所述Vpu蛋白定位在细胞核核膜上。

2.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶由SEQ ID No：1所表示的序列编码。

3.根据权利要求1或2所述的表达系统，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶的基因还含有核定位序列。

4.根据权利要求1或2所述的表达系统，其特征在于，所述真核生物为酵母、哺乳动物或昆虫。

5.一种使用T7RNA聚合酶和T7启动子的表达系统在真核生物中表达蛋白质的方法，其特征在于，所述表达系统包含HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白，所述表达系统还包含含有携带核定位序列的vpu基因和目标蛋白基因的载体，所述Vpu蛋白定位在细胞核核膜上。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)合成带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因序列，所述T7 RNA聚合酶由SEQ ID No：1所表示的序列编码，将所述带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因插入到整合型载体中；

2)将所述整合型载体线性化，回收线性化片段，转化到真核菌株中，通过抗性筛选得到基因组上整合了所述带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因的真核重组菌株；

3)构建具有携带核定位序列的vpu基因的载体，以含有目标蛋白基因的质粒为模板扩增包含有T7启动子的目标蛋白DNA片段，回收所述包含有T7启动子的目标蛋白基因片段，将其插入具有所述携带核定位序列的vpu基因的载体中，得到含有所述vpu基因和目标蛋白基因的载体；和

4)将3)得到的所述载体转化到2)中的真核重组菌株中，构建基于HIV-1逆转录病毒中的Vpu蛋白的T7 RNA聚合酶的表达系统。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)构建表达T7 RNA聚合酶和Vpu的载体，所述T7 RNA聚合酶由SEQ ID No：1所表示的序列编码；

2)将含有T7启动子、T7终止子、IRES和目标蛋白基因的DNA片段转移至所述载体，构建能够表达T7 RNA聚合酶、Vpu和目标蛋白的载体；

3)用2)中构建的载体进行转染，完成慢病毒包装；和

4)用所述慢病毒感染目标真核细胞，通过抗性筛选得到目标转化子，通过验证目标蛋白确定所述表达系统。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，选取哺乳动物的启动子作为表达T7 RNA聚合酶和Vpu的启动子，构建含有2A或者IRES的真核多顺反子结构，得到同时表达T7 RNA聚合酶和Vpu蛋白的载体。

9.根据权利要求5～8任一项所述的方法，其特征在于，使用潮霉素抗性蛋白、Nanoluc荧光素酶或增强型绿色荧光蛋白验证所述表达系统表达的目标蛋白。

10.根据权利要求5～8任一项所述的方法，其特征在于，所述核定位序列为SV40 T-Antigen核定位序列、Nucleoplasmin核定位序列、EGL-13核定位序列、c-Myc核定位序列或TUS-protein核定位序列。

11.根据权利要求5～8任一项所述的方法，其特征在于，所述真核生物为酵母、哺乳动物或昆虫。