[发明专利]快速检测THRA基因突变的引物组以及检测方法

权利要求书

1.一种快速检测THRA基因突变的引物组，其特征在于，包括THRA第3号外显子的野生型引物和突变型引物，

野生型引物分别为：

THRA-E3 F：序列如SEQ ID NO.1所示，

THRA-E3 R：序列如SEQ ID NO.2所示；

突变型引物分别为

THRA-E3 K74E F：序列如SEQ ID NO.3所示，

THRA-E3 K74E R：序列如SEQ ID NO.4所示。

2.THRA基因突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

在THRA基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；

分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物对两种突变型片段进行PCR扩增，扩增对应的突变型模板；

不同比例混合野生型模板和突变型模板，用HRM方法进行区分；

野生型引物分别为：

THRA-E3 F：序列如SEQ ID NO.1所示，

THRA-E3 R：序列如SEQ ID NO.2所示；

突变型引物分别为

THRA-E3 K74E F：序列如SEQ ID NO.3所示，

THRA-E3 K74E R：序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量，

高Tm G:CA:TG:GG:T＝G:AT:T＝A:AT:CA:CC:C低Tm。

4.根据权利要求2所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子，纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线。

5.根据权利要求2所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，所述不同比例混合这两种模板，使突变型模板的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分。

6.根据权利要求2所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，突变型模板的获取包括：利用带有突变位点的突变引物获得突变位点前后两段突变片段；将这两段突变片段连接起来，构成THRA-E3突变型模板。

7.根据权利要求2所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，野生型模板的获取包括：以已知未突变基因组为模板，THRA-E3 F+THRA-E3 R为引物进行实验，获得条带单一的特异性野生型模板。

8.根据权利要求2所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

样本处理：取外周血于EDTA抗凝管中，颠倒混匀，保存；

DNA提取：取抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；

qPCR-HRM检测，包括：对照孔的设立和检测重复孔；反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统仪器中进行程序性检测；

结果分析及判定：在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

9.根据权利要求8所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，所述qPCR-HRM检测的程序包括：95℃变性10分钟；95℃变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；72℃延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环；95℃变性60秒钟；40℃变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s。

10.根据权利要求8所述THRA基因突变的检测方法，其特征在于，通过各孔的熔解曲线图查看各孔PCR条带特异性，以野生型样品孔为基线。