[发明专利]一种山苍子组织培养方法

权利要求书

1.一种山苍子组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：以山苍子春稍带芽茎段为外植体，经预处理、消毒后，进行节杆菌属内生菌检测，筛选出外植体组织中无节杆菌属内生菌的外植体进行后续培养；

所述节杆菌属内生菌检测包括以下步骤：

在消毒后的外植体上剪取多片茎段组织碎片，置于DNA提取液中，室温静置，得到DNA粗提液；

将所述DNA粗提液与显色反应液、引物A、引物B、10000×SYBR Green I荧光染料、去离子水混合形成反应体系，进行等温扩增反应，所述引物A的序列为GGTTGTAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGC，所述引物B的序列为ATTCCAGTCTCCCCTACATCACTCTAGTCT；反应完成后，检测是否存在扩增产物，若存在，则外植体组织中存在节杆菌属内生菌；

其中，所述DNA提取液和所述显色反应液中都含有抗氧化液，所述抗氧化液中含有5-10%的二甲基亚砜和2-4‰的虾青素。

2.根据权利要求1所述的山苍子组织培养方法，其特征在于，所述预处理包括以下步骤：将所述外植体用洗洁精或洗衣粉洗涤后再置于流水下冲洗8-10小时，随后置于4-6℃的低温中处理8-12小时。

3.根据权利要求1所述的山苍子组织培养方法，其特征在于，所述消毒包括以下步骤：在无菌操作台内，将预处理完成后的外植体置于75%的乙醇中消毒10-15秒后，用无菌水冲洗4-5次，再置于0.1%的升汞溶液中消毒5-7分钟，随后同样用无菌水冲洗4-5次，再置于无菌水中备用。

4.根据权利要求1所述的山苍子组织培养方法，其特征在于，每个所述茎段组织碎片的厚度不超过1 mm，总的所述茎段组织碎片与所述DNA提取液的质量体积比为0.6-1 g：1 ml。

5.根据权利要求1所述的山苍子组织培养方法，其特征在于，所述室温静置的时间为10-15 min。

6.根据权利要求1所述的山苍子组织培养方法，其特征在于，所述DNA提取液中包括以下终浓度的各组分：20-30 mmol/l的氢氧化钠、5-10%的PEG 200和5%的抗氧化液；其中，所述抗氧化液中含有5-10%的二甲基亚砜和2-4‰的虾青素。

7.根据权利要求1所述的山苍子组织培养方法，其特征在于，所述显色反应液中包括以下终浓度的各组分：80-100 ng/μl的SSB 蛋白、100-120 ng/μl的recA 重组酶蛋白、20-40ng/μl的Bst DNA 聚合酶、80-120 mmol/l的Tricine、80-120 mmol/l的醋酸镁，5-10 mmol/l的二硫苏糖醇，5-10%的PEG 2000，2-6 mmol/l的ATP，80-100 ng/μl的肌酸激酶、180-220μmol/l的dNTP和5-10%的抗氧化液，其中，所述抗氧化液中含有5-10%的二甲基亚砜和2-4‰的虾青素；所述Tricine的pH 为8.0。

8.根据权利要求1所述的山苍子组织培养方法，其特征在于，所述反应体系以50μl计为：

显色反应液：40 μl；

10 μmol/l的引物A：0.5-1 μl；

10 μmol/l的引物B：0.5-1 μl；

10000×SYBR Green I荧光染料：1-3 μl；

DNA粗提液：1-3 μl；

去离子水：余量。

9.根据权利要求1所述的山苍子组织培养方法，其特征在于，所述等温扩增反应的时间为10-15 min；反应温度为水浴37℃。