[发明专利]针对癌细胞外泌体快速检测的试剂盒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种针对癌细胞外泌体快速定量的试剂盒，包括DNA四面体‑捕获适配体和信号适配体‑poly G，本发明引入DNA四面体纳米结构来改善捕获适配体的应用稳定性，将高特异性的核酸适配体与高灵敏性的核酸酶催化放大信号技术相结合，开发一种基于双核酸适配体的“夹心式”检测法核酸型试剂盒。本发明提供的试剂盒实现了对癌细胞外泌体的快速、准确定量，实现对外泌体的高灵敏、高通量检测，进而实现对宫颈癌的早期诊断。

技术领域

本发明属于临床诊断技术领域，具体涉及一种基于酶联核酸适配体法的核酸型试剂盒。

背景技术

肿瘤来源的外泌体(exosome)是30-100nm的有被小泡，在调控肿瘤发生和发展的过程中扮演重要角色，其表面携带大量的癌细胞来源的膜蛋白(肿瘤特异性分子)，在一定程度上是癌症生物标志物的富集体，具有较大的体外检测优势，可作为早期临床诊断的生物标志物。目前，外泌体的分析面临诸多问题：i)外泌体尺度在纳米级，难以使用流式细胞仪等细胞分析手段对其进行直接分析，而固定、标记等手段则导致灵敏度有限且可能破坏原有结构；ii)外泌体定量大多局限于SPR(表面等离子共振)或电化学等方法，需要特殊的仪器耗材，难以满足大量样本的高通量筛查。

目前，诸如针对乙肝等疾病的诊断试剂盒大多基于抗原-抗体反应、酶联放大反应和96×酶标板，具备高通量筛查优势。但抗体制备过程复杂且易存在批次间差异，增加了实际应用难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对癌细胞外泌体快速检测的试剂盒，并提供该试剂盒的制备方法，以及其具体应用，以弥补现有技术的不足。

核酸适配体(aptamer)，也称适体、适配体，经体外SELEX技术筛选得到的单链寡核苷酸序列，具有高特异性、亲和性等优势，适配体可特异性地识别外泌体表面诸如CD63等靶蛋白而与外泌体结合。同时，适配体可无批次间差异合成，可接受不同的修饰标记或整合到核酸纳米结构中，达到高效识别，应用前景广阔。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明将高特异性的核酸适配体与高灵敏性的核酸酶联放大技术相结合，同时引入DNA四面体纳米结构来改善捕获核酸适配体的应用稳定性，开发一种基于双适体的“夹心式”检测试剂盒，以实现对癌细胞外泌体的高灵敏、高特异性以及高通量检测。

具体为：

一种针对癌细胞外泌体快速定量的试剂盒，包括DNA四面体-捕获适配体和信号适配体-poly G。

进一步的，所述DNA四面体-捕获适配体和信号适配体-poly G的浓度均为2μM。

进一步的，上述试剂盒还包括氯化血红素(Hemin)和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。

所述DNA四面体-捕获适配体是指设计四条单链DNA序列，其中三条DNA序列带有生物素(B)修饰，另外一条DNA序列带有捕获适配体DNA序列，然后通过分子自组装形成底部带有B修饰，顶部带有捕获适配体的四面体纳米结构。

所述信号适配体-poly G是指将信号适配体DNA序列与poly G序列连接得到的。

上述试剂盒的制备方法包括：

(1)制备DNA四面体-捕获适配体：首先设计四条单链DNA序列，其中三条DNA序列带有生物素(B)修饰，另外一条DNA序列带有捕获适配体DNA序列，然后通过分子自组装形成底部带有B修饰，顶部带有捕获适配体的DNA四面体结构；

(2)在试剂盒的多孔板底部用链霉亲和素(SA)包被基础上，上述DNA四面体结构通过SA-B之间的特异性结合，使DNA四面体结构固定到多孔板的底部；

(3)制备信号适配体-poly G，指将信号适配体DNA序列与poly G序列连接得到。