[发明专利]一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法

说明书

本发明适用于毕赤酵母基因研究技术领域，提供了一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，通过依次复活菌株GS115和pPIC9K、培养菌株GS115和pPIC9K、合成EHT1引物、提取及鉴定菌株GS115和pPIC9K的总RNA、反转录毕赤酵母总RNA并扩增EHT1CDS区，从而方便进行后续的EHT1的进化关系分析，本发明的实验方法可以应用于发酵工程菌。

技术领域

本发明属于毕赤酵母基因研究技术领域，尤其涉及一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法。

背景技术

EHT1和EEB1编码乙酯合成酶/水解酶，单一和多重缺失分析暗示Eht1和Eeb1在MCFA乙酯生物合成中的作用，且集中在两种基因产物上。纯化GST-Eht1和GST-Eeb1融合蛋白获得结果清楚地表明，这些蛋白具有调控MCFA乙酯合成和水解两种酶活性。这与单个和多个缺失菌株中MCFA乙酯分析结果一致。EHT1或EEB1的缺失，特别是双缺失导致大部分MCFA乙酯的产生显著降低。Eht1酶对MCFA乙酯的生产具有最大的贡献。先前研究已经证实，基因ATF1、Lg-ATF1(仅存在于贮藏酵母中)和ATF2编码乙酸酯合酶。然而，ATF1和ATF2的双缺失不影响MCFA乙酯合成。鉴于eht1Δeeb1Δ双缺失突变体中的残余活性，在酵母中仍然存在涉及酯生物合成的未知基因。对从各种食品中分离到的酵母菌株进行挥发性香气成分检测，发现可以产生多种酯类物质如辛酸乙酯和己酸乙酯等。分析酵母中控制酯类合成的酶发现EHT1和EEB1主要控制中短链的脂肪酸酯，前期研究EHT1和EEB1基因的分布发现EHT1基因在所有菌株中均存在，而EEB1基因只在部分酵母菌株中存在，推测EHT1基因是酵母合成酯类所必需基因。因此分析毕赤酵母中EHT1基因进化关系，对其应用于发酵工程菌中具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，旨在分析毕赤酵母中EHT1基因进化关系，并应用于发酵工程菌。

本发明是这样实现的，一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，包括以下步骤：

S1、复活菌株GS115和pPIC9K；

S2、培养菌株GS115和pPIC9K；

S3、合成EHT1引物；

S4、提取及鉴定菌株GS115和pPIC9K的总RNA；

S5、反转录毕赤酵母总RNA，并扩增EHT1 CDS区。

优选的，其特征在于：步骤S1具体包括：

将菌株GS115和pPIC9K冻干管从4℃冰箱冷藏室取出，75％酒精棉擦拭冻干管表面，将管顶端用酒精灯外焰均匀加热；

在冻干管加热部位立即滴加2–3滴无菌水；

移取500μL5°Bé麦芽汁液体培养基加入冻干管中，使菌株GS115和pPIC9K冻干粉全部溶解；

将溶解后的菌株GS115和pPIC9K悬浮液转移到5mLEP管中，加入5,000μL5° Bé麦芽汁液体培养基，混匀。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，通过复活菌株GS115和pPIC9K、培养菌株GS115和pPIC9K、合成EHT1引物、提取及鉴定菌株GS115和pPIC9K的总RNA、反转录毕赤酵母总RNA并扩增EHT1 CDS区，从而方便进行后续的EHT1的进化关系分析，可以应用于发酵工程菌。

附图说明

图1为本发明的具体实施方式的毕赤酵母EHT1测序结果示意图。

图2为本发明的具体实施方式的EHT1氨基酸序列示意图。