[发明专利]表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒构建及其应用

权利要求书

1.溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的应用，其特征在于：用于制备治疗消化道恶性肿瘤疾病的药物；所述消化道恶性肿瘤疾病为胰腺导管腺癌；

表达ST13和TRAIL的溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建pXC2-CEA质粒；

(2)构建pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒；

(3)利用Pme I内切酶线性化pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒并将其转化至含Adeasy-1腺病毒骨架系统的BJ5183大肠杆菌中同源重组，产生由CEA启动子控制E1A区同时缺失E1B 55KDa基因的腺病毒质粒；

(4)通过脂质体转染步骤(3)所得的重组腺病毒质粒至HEK293细胞，得到溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制胰腺导管腺癌移植瘤生长。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的制备包括以下步骤：

(1)构建pXC2-CEA质粒：

将CEA质粒插入到Xho I和SnaB I双酶切的pXC2质粒中，并取代pXC2上E1A区的野生型启动子，得到携带CEA启动子的pXC2-CEA质粒；

(2)构建pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒：

首先利用Xho I和Xba I分别对pXC2-CEA和pSD55进行双酶切，并将双酶切后的两个大小片段相连，得到pSD55-CEA；

通过PCR获得目的基因，插入目的基因至pCA13载体上Hind III和EcoR V位点，得到pCA13-TRAIL-IETD-ST13；

然后用Bgl II分别酶切pSD55-CEA和pCA13-TRAIL-IETD-ST13，连接经酶切后的两个大小片段，得到pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒；

(3)腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL的构建：

利用Pme I酶切线性化pSD55-CEA-ST13-IETD-TRAIL质粒并将其转化至含Adeasy-1腺病毒骨架系统的BJ5183大肠杆菌中进行同源重组，产生由CEA启动子控制E1A区同时缺失E1B 55KDa基因的腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL；

(4)溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的构建：

利用Mlu I酶切鉴定腺病毒质粒pCD55-ST13-IETD-TRAIL是否正确；将鉴定正确的腺病毒质粒用Pac I酶切线性化后转染至HEK293细胞中，待细胞基本病变，得到溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：溶瘤腺病毒CD55-ST13-TRAIL的鉴定为：对构建的溶瘤腺病毒进行Western blot鉴定，检测腺病毒感染肿瘤细胞是否表达治疗基因ST13和TRAIL。