[发明专利]一种光感细胞焦亡质粒的设计方法

说明书

本发明公开一种光感细胞焦亡质粒的设计方法。步骤包括：1)质粒构建基于pEGFP‑N1载体，使用标准的CMV启动子。拟南芥隐花色素2(Cry2)基因和隐花色素相互作用的Cib基因。在Cib1‑GSDMD插入一个等离子膜定位CAAX信号(‑K‑K‑K‑K‑K‑K‑S‑K‑K‑T‑K‑C‑V‑I‑M)，形成Cib1‑GSDMD‑CAAX结构。在Cry2的C端加入Caspase‑1，形成Cry2‑Caspase‑1结构，表达Cry2‑Caspase‑1蛋白。2)从正常组织或细胞中提取总RNA，并将其拟转录成cDNA，再以此为模板，设计针对GSDMD和Caspase‑1的引物来对其进行PCR扩增，随后分别连接至含有Cib和隐花色素2(Cry2)基因并分别带有GFP和mCherry荧光蛋白基因的真核表达载体中，转化大肠杆菌，然后挑取阳性克隆并进行基因测序，最后提取目的质粒。

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种光感细胞焦亡质粒的设计方法，该质粒在蓝光照射下可以诱导细胞发生焦亡。

背景技术

细胞焦亡是机体一种细胞死亡的方式，自然情况下不可控，是由GSDMD介导的细胞程序性坏死。细胞发生焦亡时，GSDMD分成GSDMD-C和GSDMD-N两段。当GSDMD-N定位在细胞膜上时，细胞发生焦亡。光遗传学又称为光遗传操控技术，是将光控技术与遗传学相结合以进行细胞生物学研究的新技术，通常是将光感蛋白基因转导入目的细胞内，借助光束具有高时空分辨率的特性，实现目的蛋白在分子水平上的精准靶向聚集。光敏感蛋白是一种在特定光照下进行聚合的蛋白，Cry2和Cib是一对在蓝光下可以进行结合的蛋白。设计细胞焦亡敏感质粒A(Cry2-GSDMD-CAAX)和辅助蛋白质粒B(Cib-Caspase-1)，在蓝光照射下Cry2和Cib结合的同时带动GSDMD和Caspase-1结合。Caspase-1对GSDMD切割成为GSDMD-N和GSDMD-C两段，GSDMD-N被CAAX定位在细胞膜上，进而诱导细胞焦亡。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种光感细胞焦亡质粒的设计方法。

本发明的技术方案包括一种光感细胞焦亡质粒的设计方法，包括如下步骤：

1)质粒构建基于pEGFP-N1载体，使用标准的CMV启动子。拟南芥隐花色素2(Cry2)基因和隐花色素相互作用的基-螺旋环-螺(Cib)基因。在Cib1-GSDMD插入一个等离子膜定位CAAX信号(-K-K-K-K-K-K-S-K-K-T-K-C-V-I-M)，形成Cib1-GSDMD-CAAX结构。在Cry2mCherry的C端加入Caspase-1，形成Cry2-Caspase-1结构，表达Cry2-Caspase-1蛋白。

2)从正常组织或细胞中提取总RNA，并将其拟转录成cDNA，再以此为模板，设计针对GSDMD和Caspase-1的引物来对其进行PCR扩增，随后分别连接至含有Cib和隐花色素2(Cry2)基因并分别带有GFP和mCherry荧光蛋白基因的真核表达载体中，转化大肠杆菌，然后挑取阳性克隆并进行基因测序，最后提取目的质粒。两种质粒分别称之为光控焦亡前体蛋白质粒A(Cib-GSDMD-CAAX)和辅助蛋白质粒B(Cry2-Caspase-1)。

本发明设计的光感细胞焦亡质粒有以下几大优点：1)在任何细胞表达光感细胞焦亡质粒，在蓝光照射时细胞都发生焦亡，而没有蓝光时细胞正常，可控性强；2)涉及的光感细胞焦亡质粒应用广泛，体内外研究都适合。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一的说明。

实施例1：

光感细胞焦亡质粒的设计方法：