[发明专利]一种流行性出血病病毒及血清型鉴定RT-PCR试剂盒

说明书

本发明涉及一种流行性出血病病毒及血清型鉴定RT‑PCR试剂盒，属于兽医传染病检测技术领域。本试剂盒包括：（1）检测流行性出血病病毒的特异性引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示；（2）8对检测不同血清型流行性出血病病毒的引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.18所示；（3）反应试剂与阳性、阴性核酸对照。本发明具有灵敏度高、特异性好、快速简便、成本低廉的优势，一方面不仅可准确的对EHDV及其血清型进行鉴定，另一方面通过对扩增病毒的核酸序列测序，获取流行性出血病病毒的关键遗传特征，为分析病毒的进化特征提供数据。

技术领域

本发明属于兽医传染病检测技术领域，具体涉及采用反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测流行性出血病病毒核酸并对病毒的血清型进行鉴定的试剂盒。

背景技术

流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)感染引起的流行性出血病(Epizootic haemorrhagic disease,EHD)是一种严重侵害反刍动物的虫媒病毒病。EHDV主要通过吸血库蠓(Culicoides.spp)对动物叮咬进行传播，可感染包括绵羊、山羊、黄牛、水牛、鹿以及美洲羊驼在内的多种反刍动物。本病对鹿和牛的危害最为严重，可引起感染动物体温升高、口腔与皱胃黏膜发生出血与糜烂、蹄冠出血和跛行，妊娠期动物出现流产或死胎，奶牛或哺乳期动物的产奶量急剧减少。EHDV主要流行于北纬49度至南纬35度之间的热带、亚热带及温带地区，疫病的爆发给牛羊养殖业带来严重的经济损失，阻碍畜产品的正常国际贸易。近年来随着全球气候变暖，媒介昆虫活动日益频繁，EHDV-1型、EHDV-2型、EHDV-6型与EHDV-7型病毒多次在中东地区、亚洲、北美洲与南美洲的牛群中引起EHD疫情的爆发，表明EHDV的分布范围与致病性呈逐步增加趋势，引起了世界动物卫生组织(OIE)的高度关注，2008年本病被OIE列为法定报告的跨境动物疫病。

EHDV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，基因组由10个双链RNA节段(Seg-1至Seg-10的)构成。Seg-3编码的VP3是构成环状病毒属的内层衣壳的主要蛋白，EHDV的Seg-3/VP3的核苷酸和氨基酸序列在不同血清型EHDV毒株之间高度保守，核酸序列相似度80.1％，氨基酸序列相似度94.5％，是通过分子方法鉴定EHDV群特异性的重要靶序列。Seg-2编码的病毒外层衣壳蛋白VP2，是诱导感染动物产生异性中和抗体的主要蛋白，决定着EHDV的血清型，是通过分子方法确定EHDV血清型的唯一靶基因。EHDV的Seg-2/VP2具有高度变异的特性，不同血清型EHDV毒株之间Seg-2核酸序列的相似度在43.8％～70.1％之间，VP2氨基酸序列相似度在29.4％～72.2％之间。值得注意的是，同一种血清型的不同地域毒株间Seg-2核酸序列的差异度可达29.5％，据此可将同一种血清型EHDV毒株进一步分为两种地域型，Eastern型与Western型。澳大利亚、日本和中国的分离的EHDV均属Eastern型，而分离自美洲、非洲、中东的EHDV毒株为Western型。