[发明专利]一种提高外源核酸转化效率的方法

说明书

一种提高外源核酸转化效率的方法，HGFI是一种灰树花真菌中产生的高表面活性蛋白，通过质粒DNA与HGFI的复配，提高利用外源核酸转化受体菌的效率。本方法大致可分为4步：1.毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达真菌疏水蛋白HGFI并纯化，获得纯度95％以上的HGFI蛋白，作为复配样品。2.将HGFI与质粒以固定比例10:1混合得到质粒浓度为10μg/mL的混合液。3.将混合液于30℃恒温培养箱中静置温浴1h。4.将处理后的质粒混合物以化学转化法转化入受体菌中。该转化方法使目前分子生物学中常用的工程菌大肠杆菌DH5α的转化率增加约60％，操作效率的提高可为科研工作者提供巨大便利。

技术领域

本发明涉及生物分子操作技术领域，尤其涉及一种外源DNA转化至某一种受体菌的方法。

背景技术

DNA转化是现代分子生物学最基本和最常见的操作技术之一，在分子生物学遗传操作中占据基础地位。受体菌经转化可以获得外源DNA，从而表达出稳定的可遗传的性状。常见的转化方法大体可分为两类：1.化学转化，分为两个阶段，首先制备获得可以接受外源DNA的感受态细胞，其次DNA进入细胞并且稳定复制表达。化学转化法通常适用于革兰氏阴性菌转化。2.电穿孔转化。约5–10kV/cm的电压电击5–10μs即可使各种不同的细胞表面形成孔洞，因此可以促进外源DNA分子的吸收，该方法适用性较为普遍，包括革兰氏阳性和阴性细菌。

转化效率的高低直接影响到前后实验的进展和工作效率。为了提高转化率，40年来科研工作者在上述两种基本转化方法基础上进一步改善和延伸出一些方法。但是这些方法在追求转化率的同时或多或少增加了转化流程的复杂性。就目前状况来看，转化率仍然是分子生物学发展瓶颈。高效的DNA转化效率对于在感受态细胞中基因的成功克隆和表达有着十分重要的意义。自从Griffith发现了转化现象，从感受态细胞到目的转化子的筛选成为分子生物学遗传操作的经典过程，而转化率的高低往往决定实验的成败。Mandel等利用CaCl₂处理细菌，可以提高外源DNA的转化率。影响转化率的因素很多，完整质粒的转化率一般比重组质粒连接产物高3-4个数量级，另外，感受态细胞的状态、外源DNA的大小、数量和质量等都是影响转化效率的关键因素。目前的研究主要在菌株的生理状态、菌的数量、温度控制等方面进行了探索。新世纪以来，世界范围内科学家开始在分子生物学水平研究越来越多的新的微生物门类，而在这个过程中通常会遇到外源质粒无法转化进入目的细菌的难题。在细菌基因组研究中，大质粒的研究目前同样因为转化技术制约而不能有效开展。

化学转化中为了提高转化率，有时会添加化学辅助剂。例如二价阳离子，可以中和DNA上磷酸基团所带的负电荷，因而有利于外源DNA进入宿主细胞。此外还有两亲性的物质，例如二甲基亚砜(DMSO)、环糊精。但是DMSO、环糊精可扰乱细胞膜分布，具有细胞毒性，并且可用浓度低有时需要优化。此外，化学转化对所应用的化学辅助剂的纯度要求比较高，非常容易影响转化率和转化子的存活率。

迄今为止，还未见将质粒DNA与真菌疏水蛋白HGFI复配转化相关的专利，罕见真菌疏水蛋白HGFI应用生物分子操作领域的相关文章，且未见过将质粒DNA与真菌疏水蛋白HGFI复配提高转化率的成功案例。

发明内容

本发明目的是解决现有转化方法对部分外源DNA转化效率较低的问题，提供一种将质粒DNA与真菌疏水蛋白HGFI复配转化方法，以提高受体菌转化效率。

本申请发明人通过对真菌疏水蛋白HGFI及大肠杆菌转化的深入研究，对质粒DNA与真菌疏水蛋白HGFI复配转化进行了一系列实验，首先将质粒DNA与真菌疏水蛋白HGFI复配转化证明其可行性同时可以提高转化率，其次通过调整质粒DNA与真菌疏水蛋白HGFI复配比例证明两者合适比例有利于提高复配转化效率，最后对质粒DNA与真菌疏水蛋白HGFI复配提高转化率的机理进行探究，HGFI借助其包裹与自我组装特性通过包裹质粒产生保护作用，减缓了核酸酶对质粒的降解并使之维持在一个相对较好的质量，从而提升了转化效率。并且以质粒pUCP19与真菌疏水蛋白HGFI复配转化大肠杆菌DH5a实施例验证了该方法在实践上的可行性。