[发明专利]用于早期胰腺肿瘤检测分子标志物、其检测方法及应用

说明书

本发明公开了用于早期胰腺肿瘤检测分子标志物、其检测方法及应用，属于生物技术及临床分子诊断药物开发领域。该胰腺癌标志物miRNAs：miR‑30c、miR‑24、miR‑23a和miR‑132。本发明所提供的组合、方法和试剂盒能够用于早期胰腺癌的筛查与鉴别诊断、疾病并发症发生和复发的监测、疗效、药效及指导精准用药等方面评价，具有检出谱系广、灵敏度高、特异性好、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于胰腺癌早期普查和预后等相关工作，改进单一的标记物或目前临床广泛应用的生物标志物本身的不稳定性所难以克服的个体差异、所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高早期胰腺癌的临床检出率、降低对胰腺癌误诊率和漏诊率，成为早期胰腺癌筛查和诊断的有效手段。

技术领域

本发明属于生物技术及临床分子诊断药物开发领域，特别涉及能区分早期胰腺癌、胰腺炎及胰腺导管内乳头状黏液肿瘤病变以及正常人血液检测标志物、PCR(多聚酶联反应)或任何以这些标志物为检测手段的方法和试剂盒。

背景技术

早期胰腺癌通常指肿块直径≤2.0cm，无淋巴结转移，无胰腺被膜和胰周浸润，无血管和邻近脏器侵犯的胰腺癌，分期属T1aN0M0。但是有学者认为，1.0cm～2.0cm的胰腺癌大多已发生了淋巴结转移，主张肿瘤直径≤1.0cm为早期胰腺癌的标准。除非病灶恰巧位于十二指肠乳头处，可以早期出现胆胰管梗阻症状以外，极少有临床症状。另有学者提出，早期胰腺癌和小胰腺癌的定义有所区别，后者主要是指肿瘤最大直径≤2.0cm，而无论有无淋巴结转移。因此，早期胰腺癌的诊断，应重点在于高危人群的筛查、分子生物学诊断和探索新的影像检查手段。

目前临床应用最为广泛的胰腺癌诊断手段，即应用多种影像学方法来鉴别疑似胰腺癌患者的肿瘤，其中包括腹部B超、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、内镜超声(EUS)和正电子发射断层扫描(PET)。由于胰腺癌肿瘤所处于人体内脏的深处，在初期没有明显的临床表现，并且在微小癌灶时期难以用放射成像进行诊断，导致大部分胰腺癌患者在确诊时已进入晚期，病灶已经转移，患者丧失用手术进行治疗的机会。

考虑到影像检测手段的局限性，研究者们开始思考是否可以利用人体体内的某些生物分子作为诊断靶标，从而提高诊断的特异性。因此在近些年，人们热衷于开发新型生物标志物。关于胰腺癌的生物标志物的研究也有很多，但是很少能被证明是有效的检测早期胰腺癌。目前，碳水化合物类抗原19-9(CA 19-9)是应用最广泛的胰腺癌生物标志物。然而，由于CA19-9、CA125、CA50、TIMP-1、及CEA对胰腺癌的诊断敏感性和特异性都较低(都在30～40％和60％左右)，因此它们并不是筛查和早期检测胰腺癌的最佳诊断标，其主要临床应用是作为监测病情进展和治疗反应的标志物。

现有技术中CN101942502A和发明人的在先申请CN109423519A虽然公开了采用微小核糖核酸作为检测临床早期胰腺癌诊断的用途，但现有技术中都是用单一检测指标来判断，并且所发明的单一miRNAs并不是最灵敏的，不是最能反映临床病人体内实际情况的，缺乏综合考虑每种miRNAs个体化临床上表征，有可能导致其产品检测结果不能真实反映病人实际状况，造成漏诊和误诊。

传统的miRNA的检测技术主要是Northern Blotting印迹法、微阵列、原位杂交(ISH)和核酸扩增技术。如今，尽管在开发miRNA检测技术的研究方面已经取得许多进展，但是仍然存在以下的问题亟待解决：

1)目前，虽然已经报道了许多种miRNA检测方法，但可商业化且推广至临床的技术主要还是PCR。但是普通的RT-PCR并无法达到实际所要求的高灵敏度、准确性以及特异性，并且面对临床大规模样品，如何实现快速且大批量检测是技术难点；

2)通常一个miRNA可以同时调控多种功能，与多种疾病息息相关。因此，开发可同时检测多种目的miRNA的高通量检测技术是非常重要的；