[发明专利]VWB-attP和φC31-attP整合酶介导的基因重组方法及在链霉菌中应用

说明书

本发明提供了一种VWB‑attP和φC31‑attP整合酶介导的基因重组方法及在链霉菌中应用。具体地，本发明利用VWB‑attP整合酶和φC31‑attP整合酶系统介导的位点特异性整合机制将这两种整合酶模块构建在同一个含有目的基因的质粒中，通过属间接合转移可快速将需要表达的目的基因以多拷贝的数量重组至链霉菌染色体的相应attB位点上。本发明的方法在阿维菌素，红霉素和林可霉素产生菌中进行了应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体的，涉及利用VWB-attP整合酶和φC31-attP整合酶系统介导的位点特异性整合重组机制，获得在链霉菌染色特上导入多拷贝数量的目的基因

背景技术

链霉菌是自然界存在的一类可代谢产生天然产物的菌种，在医药工业应用领域，大部分抗生素原料药都是通过链霉菌发酵生产。如红霉素是通过红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)发酵生产，阿维菌素是通过阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)发酵生产，林可霉素是通过林可链霉素(Streptomyces lincolnensis)发酵生产。随着生物技术的发展，通过对链霉菌进行基因改造，可解决工业菌种生产过程中的产量以及组分问题。对于外源基因的引入，可通过同源重组和位点特异性整合的技术来实现。由噬菌体整合酶介导的位点特异性整合方式，具有较高的稳定性，不易发生回复突变，已成为链霉菌中引入外源基因的主要方法。

根据不同的链霉菌基因组中是否存在相应种类整合酶识别的attB位点序列，可在体外通过质粒构建相对应的整合酶attP模块，最后将重组质粒导入至链霉菌宿主中，即可实现目的基因在染色体上的特异性整合。本发明人已授权专利(ZL200910194419.4ΦC31介导的基因重组和应用于红霉素产生菌的遗传改造)采用ΦC31整合酶attP介导的位点特异性重组方法，成功将体外构建的目的基因序列重组至外源引入的红霉素产生菌attB位点上，实现了外源构建的目的基因一个拷贝数量的增加。

尽管现有技术中存在整合酶介导的基因重组方法，但是其应用范围还很有限，本领域仍然需要进一步地开发并优化链霉菌的基因重组方法，以期进一步地提高其生物合成的能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种VWB-attP和φC31-attP整合酶介导的基因重组方法及在链霉菌中应用。

在本发明的第一方面，提供了一种利用VWB-attP和φC31-attP整合酶介导的基因重组方法，其特征在于，包括步骤：

(1)在链霉菌的基因组中引入至少1个外源的attB位点，获得携带有外源attB位点的链霉菌；

(2)将包含(i)ΦC31整合酶模块和/或VWB整合酶模块、和(ii)目的基因或目的基因簇的载体引入到步骤(1)的链霉菌中，选择目标基因或目标基因簇整合到链霉菌基因组内源attB位点以及外源attB位点的链霉菌，从而获得整合入多拷贝基因或基因簇的链霉菌。

在另一优选例中，所述的链霉菌包括阿维链霉菌、红色糖多孢菌、林可链霉菌，较佳地为林可链霉菌。

在另一优选例中，所述外源的attB位点包括ΦC31整合酶所识别的attB位点和VWB整合酶所识别的attB位点

在另一个优选例中，所述的至少1个外源的attB位点为1-2个外源的attB位点；较佳地为1个外源的attB位点。

在另一优选例中，所述的链霉菌为林可链霉菌，并且(i)所述外源的attB位点引入到林可链霉菌基因组的Cysteate NRPS基因簇中，较佳地，取代该基因簇的原SLINC0744基因；和/或

(ii)所述外源的attB位点引入到林可链霉菌基因组的Moenomycin基因簇中，较佳地，取代该基因簇的原SLINC6338基因、SLINC6339基因和SLINC63340基因。