[发明专利]细胞角蛋白19片段抗原及其制备方法和应用

说明书

一种细胞角蛋白19片段抗原及其制备方法和应用，其特征在于：所述的CYFRA21‑1抗原是由体外培养的肺癌细胞系通过小分子激活剂处理后引起细胞程序性凋亡，并释放CYFRA21‑1抗原。本发明的优点在于小分子激活剂PAC‑1可在短期内激活半胱天冬酶‑3酶原，酶解细胞角蛋白19，促使体外培养的肺癌细胞系按照程序性凋亡的方式制备CYFRA21‑1蛋白，该方法制备的蛋白是人体天然蛋白，用作试剂盒校准品性能稳定、抗原抗体亲和力高。该方法制备的抗原稳定性良好，抗原制备周期短，抗原得率高，抗原粗提纯后可用于CYFRA21‑1检测试剂盒校准品。

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种细胞角蛋白19(CYFRA21-1)片段抗原及其制备方法和应用。

背景技术

细胞角蛋白19片段抗原(cytokeratin 19fragment 21-1，CYFRA21-1)是Ⅰ型细胞角蛋白19(CK19)的第239～400aa的可溶性片段，由于该片段可被KS19.1和BM19.21两株单克隆抗体特异性结合而命名为CYFRA21-1。

细胞凋亡可引起半胱天冬酶介导的Ⅰ型细胞角蛋白的水解，使大量CK19形成可溶性的CY21-1进入血液中，而正常人血清中CY21-1的含量较低(＜3.3ng/mL)，因此，血液CY21-1浓度的升高可被用于肿瘤患者的诊断。有研究表明肺癌细胞系中半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)mRNA表达水平与CYFRA21-1表达量高低呈正相关，体外培养的细胞中添加caspase 3抑制剂，CYFRA21-1表达水平升高。这表明caspase 3在CYFRA 21-1生成中起重要作用(Dohmoto K,Hojo S,Fujita J,Yang Y,Ueda Y,Bandoh S,Yamaji Y,Ohtsuki Y,Dobashi N,Ishida T,et al.The role of caspase 3in producing cytokeratin19fragment(CYFRA21-1)in human lung cancer cell lines.Int J Cancer.2001；91:468–473)。Caspase家族中其它蛋白酶也有可能参与该酶解过程，只是还没有相关研究。

据报道，一种名为procaspase激活化合物1(PAC-1)的化合物可在体外增强procaspase-3的活性，并在体外培养小鼠异种移植模型的癌细胞中诱导凋亡性死亡。并进一步证明，PAC-1在体外是通过螯合抑制性锌离子从而激活procaspase-3生成caspase-3(Peterson QP,Hsu DC,Goode DR,Novotny CJ,Totten RK,Hergenrother PJ.Procaspase-3activation as an anti-cancer strategy:structure-activity relationship ofprocaspase-activating compound 1(PAC-1)and its cellular co-localization withcaspase-3.J Med Chem.(2009)52:5721–31)。

市面上在售的CYFRA21-1校准品级天然抗原大多是由肺癌细胞系体外培养，细胞自然凋亡释放CYFRA21-1蛋白，细胞连续培养7～14天，细胞上清中抗原含量为10～100ng/ml，用该细胞上清纯化制备CYFRA21-1抗原，会出现工作量大、抗体纯度低、抗原制备成本大等问题，间接导致CYFRA21-1抗原购买价格昂贵。因此寻找方法提高体外培养肿瘤细胞CYFRA21-1抗原表达量是必要的。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能促使体外培养的肺癌细胞系程序性凋亡，并在一周内将细胞培养基中抗原分泌量提高20～100倍的CYFRA21-1抗原。

为了解决上述技术问题，本发明的技术解决方案如下：一种CYFRA21-1抗原，所述的CYFRA21-1抗原是由体外培养的肺癌细胞系通过小分子激活剂处理后引起细胞程序性凋亡，并释放CYFRA21-1抗原。