[发明专利]一种结直肠癌多基因甲基化联合检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种结直肠癌多基因甲基化联合检测试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明的试剂盒提供了SEPT9，SDC2，SFRP2，NDRG4，SPG20，FBN1基因的CpG岛甲基化检测的引物和探针，采用重亚硫酸盐荧光定量PCR法进行基因甲基化的检测。本发明为评估结直肠癌的潜在可能性提供了有效的手段和依据，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及结直肠癌SEPT9、SDC2、SFRP2、NDRG4、SPG20、FBN1多基因甲基化联合检测试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术

DNA甲基化是基因表观遗传的一种修饰方式，DNA的甲基化能够关闭一些基因的活性。DNA的甲基化发生在CpG的胞嘧啶上，在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式在不改变DNA序列的前提下，对基因的表达进行调控，在维持细胞的正常功能、胚胎发育生长和人类肿瘤发生中起着重要作用。

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是全球发病率第三位的癌症，2012年全球确诊136万例CRC，这一数字每年仍以2％的速度增长，中国更是达到4.2％的年增长率。CRC的早期筛查是降低发病率与病死率的最有效手段之一。统计表明，早期诊断并治疗可使CRC患者5年生存率达到90％，而在晚期发生远处转移的患者，其5年生存率只有10％。CRC从早期发展到晚期大约需要10年时间，这就使CRC患者有大量的时间和机会早期发现和治疗。CRC常用的传统筛查方法包括结肠镜检查、粪便潜血实验、CT结肠重建等。其中结肠镜检为诊断CRC的金标准，但仍有5％的漏检率，且操作复杂，镜检过程中患者痛苦、依从性差。近年来发展起来的分子标志物检测CRC的方法，其敏感度和特异性越来越高，且安全、无创。只需取少量的患者血液或粪便，从中筛选特异性分子标志物即可。将结直肠癌分子标志物SEPT9、SDC2、SFRP2、NDRG4、SPG20和FBN1基因的甲基化进行联合检测，将大大提高结直肠癌早期筛查的敏感度和特异性。

SEPT9(Septin9)基因是一类具有三磷酸鸟苷酶活性的保守基因家族成员之一，与染色体分离、DNA修复、迁移和凋亡等许多细胞功能有关。SEPT9与诸如恶性肿瘤等人类疾病发生密切相关，且SEPT9已成为现阶段肿瘤相关研究的新热点，SEPT9基因在结直肠癌发生中起抑癌基因作用，SEPT9基因甲基化会抑制该基因正常表达，使其抑癌功能丧失，并最终导致细胞分裂和癌变。SEPT9基因在结直肠肿瘤组织中高度甲基化，其甲基化异常是结直肠癌的重要分子特征，而其在外周血和粪便中的改变可用于结直肠癌的早期诊断。

有研究分析了大肠癌患者的癌组织以及癌旁组织的甲基化情况，筛选出具有显著差异的黏结蛋白聚糖2(syndecan-2，SDC2)甲基化基因。在粪便样本的SDC2基因甲基化的研究中发现在特异性为90.9％时，大肠癌的检测敏感性为90.0％。相对于正常组织，SDC2基因在大肠癌和腺癌组织中呈现高水平的甲基化现象，并且SDC2基因在大肠癌和腺癌组织中的表达也显著高于正常组织。SDC2基因在大肠癌不同分期中呈现高度的甲基化，这一现象预示着其作为大肠癌诊断标志物具有较高的价值。

SFRP2基因定位于人染色体4q31，是肿瘤发生通路-Wnt信号通路的信号拮抗因子之一，研究发现90％以上的大肠癌在癌变早期发生Wnt信号通路异常。SFRP2基因的第1个外显子周围有着与肿瘤细胞DNA甲基化密切相关的高密度CpG岛，当它发生甲基化而导致转录沉默时，其拮抗Wnt信号的作用减弱或消失。从而导致肿瘤的发生。变性隐窝灶、增生性息肉和腺瘤被认为是大肠癌变过程中的早期病变。SFRP2基因在这些癌前病变中发生频繁的超甲基化，因此通过检测它的甲基化来筛查大肠癌，能有效降低大肠癌的发生率。