[发明专利]一种用特异性PCR引物检测双季槐槐米的方法

说明书

本发明提供了一种用特异性PCR引物检测双季槐槐米的方法，该方法是基于双季槐槐米的ITS序列，设计出两对可快速检测双季槐槐米的特异性引物，并在此基础上建立了PCR检测体系，可扩增出720bp左右的单一DNA条带，为双季槐槐米的药材鉴别提供了分子鉴定依据。该特异性引物建立的检测方法具有操作简便、特异性好、灵敏度高等优点，可实现对双季槐槐米的检测。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学检测技术，具体属于一种用特异性引物PCR检测双季槐槐米的方法。

背景技术

槐树(Sophora japonica L.)，又名国槐、中国槐等，为豆科槐属的多年生落叶乔木，是一种集药用、食用、材用、观赏于一体的优良树种。米槐，是以国槐砧木嫁接的专用于生产槐米的经济作物，具有国槐的生态学特性，喜光、抗旱、耐瘠薄，对土壤要求不严格，适宜在丘陵山地、沟边地、旱坡地栽植。槐米为米槐的花蕾，是我国常用大宗出口中药材之一，具有凉血止血、清肝泻火的功效，主治便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等，具有凝血止血，抗炎，解痉、抗溃疡，强心、扩张冠脉、降压、调血脂等药理作用，临床常用于治疗高血压、冠心病、防治脑溢血及吐血、风热目赤等疾病。槐米在医疗、保健、化工等方面均有重要用途，但多年来，米槐的种植一直没有形成规模产业，导致槐米的采收总量一直不高。经调研发现，目前国际市场上90％的槐米产自中国，而国内药企对槐米的年需求量则为8000吨左右，导致槐米供不应求，因此以槐米作为研究对象具有重要意义。双季槐作为近年来研发的新品种米槐，其主要特点是有两季结米期，大大提高了槐米产量，但其质量优劣还未知，因此，建立一种双季槐槐米的鉴别方法，以区分单、双季槐米，为后续单、双季槐的槐米中有效成分的分析和质量控制奠定基础，很有必要。

核糖体基因内部转录间隔区(ITS)序列存在于高度重复的核糖体中，进化速度快且长度不大，加上协同进化，使该片段在基因组不同单元间十分一致，因而适合进行各种分子操作。由于该区域受外界环境因素的影响较小，进化速度快，因而具有种内变异小而种间变异大的特点，是种类鉴定和系统发育分析的重要分子标记，可用于生物分类、系统发育和遗传多样性的研究。

本发明依据分子标记技术原理和原则，设计出两对双季槐槐米特异性PCR鉴别引物，并建立了一种特异性区分双季槐槐米的分子鉴别方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测双季槐槐米的特异性PCR引物，以及用该特异性PCR引物快速、准确地检测双季槐槐米的方法。

为实现上述目的，本发明提供的一种用于检测双季槐槐米的特异性PCR引物对，所述的特异性引物对是如下(1)和(2)引物对中的任意一对：

(1)上游引物F1：5＇GCAATGCGAGCACTGCTT 3＇

下游引物R1：5＇TCGTTCCCCGTGGGGGCGA 3＇

(2)上游引物F2：5＇GCAATGCGAGCACTGCTT 3＇

下游引物R2：5＇CGGGTGCGGGACTAGTCT 3＇

本发明提供的一种用特异性PCR引物检测双季槐槐米的方法，包括以下步骤：

1)提取槐米样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，使用上述引物中的任意一对进行PCR扩增反应；

3)对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判定样品是否为双季槐槐米；

其中，PCR扩增反应体系以25μL计为：

所述的引物对的PCR反应条件：