[发明专利]一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法

权利要求书

1.一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法，其特征是，包括以下步骤：

1)提取患者原代蜕膜淋巴细胞；

2)将所获得的蜕膜淋巴细胞进行分选，获得蜕膜NK细胞；

3)将获得的蜕膜NK细胞在含有100ng/ml IL-15的RPMI-1640培养基中培养三天，第三天晚上加入细胞内刺激因子；

4)第四天收集蜕膜NK细胞，并用CD3、CD56、IFN-γ、VEGFα的流式抗体将其染色；

5)在流式细胞分析仪上圈出CD3^—CD56⁺的细胞群体，分析该细胞群中IFN-γ、VEGFα的表达。

2.根据权利要求1所述的一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法，其特征是，步骤1)具体为：

1.1)在不明原因复发性流产患者清宫当天，收集蜕膜，用pH＝7.4的无菌磷酸盐缓冲液漂洗；

1.2)将蜕膜组织剪碎成1立方毫米的小碎片，用PBS重悬为组织混合液，再利用1mg/ml的胶原酶和0.01mg/ml的DNA酶对组织混合液消化40分钟；

1.3)消化后的组织液用70μm的无菌滤器过滤，然后将过滤后的组织液加入等体积的淋巴细胞分离液ficoll上，保持液面分界清晰，再用离心机离心，转速为500g，离心30分钟；离心完成后吸取中间的细胞层，即为所获得的蜕膜淋巴细胞。

3.根据权利要求1所述的一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法，其特征是，步骤2)具体为：

2.1)将MACS分选试剂盒的分选缓冲液加入细胞沉淀，300g，离心5min；

2.2)去上清，沉淀细胞计数，每1×10⁷个细胞加入40μl分选缓冲液和10μl MACS分选试剂盒生物素化抗体，重悬，4℃放置5min；

2.3)再加入30μl分选缓冲液和20μlMACS分选试剂盒磁珠每1×10⁷个细胞，重悬，4℃放置10min；

2.4)用500μl分选缓冲液先润洗磁柱，再将步骤2.3)得到的细胞悬液加入磁柱，最后再用500μl分选缓冲液冲洗一遍；

2.5)沿磁柱留下的细胞悬液中的细胞即为NK细胞，再加入分选缓冲液，300g，5min清洗一遍即可。

4.根据权利要求1所述的一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法，其特征是，步骤3)具体为：将获得的蜕膜NK细胞在含有100ng/ml IL-15、体积分数为10％胎牛血清和体积分数为1％的链霉素/青霉素双抗的RPMI-1640培养基中培养3天，于第3天晚上加入细胞刺激因子混合物即佛波醇酯12-十四酸酯13-乙酸酯和离子霉素。

5.根据权利要求1所述的一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法，其特征是，步骤4)具体为：

第4天收集蜕膜NK细胞，400g，离心5min，PBS清洗，向沉淀中加入100μlPBS和荧光标记的流式抗体：CD3-PeCy7、CD56-APC，混匀，室温下孵育30min；PBS清洗后加入固定破膜液，室温孵育1小时，PBS清洗；向沉淀中加入100μlPBS重悬再加入荧光标记的胞内细胞因子流式抗体：IFN-γ-FITC、VEGFα-PE，混匀，室温下孵育30min。