[发明专利]一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种双功能酶生物催化剂，其特征在于：所述双功能酶生物催化剂为同时具有羰基还原氨化和辅酶再生能力的高效表达双功能酶的重组大肠杆菌全细胞，所述双功能酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述双功能酶生物催化剂的制备方法，其特征在于，采用如下步骤：

步骤(1)

用基因重组技术，将编码权利要求1中所述双功能酶的全长基因tlf连接到载体pET28a上，形成质粒pET28a-tlf；

步骤(2)

将步骤(1)形成的质粒pET28a-tlf转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)，接种卡拉霉素抗性的Luria-Bertani(LB)液体培养基，放大培养，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶，4℃离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，既得。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养时间为24-72小时。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养温度为16-30℃。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的卡拉霉素的浓度为50-200μg/L；所述诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，浓度为0.4-1.0mM。

6.权利要求1所述双功能酶生物催化剂在合成(S)-环丙基甘氨酸中的应用。

7.一种(S)-环丙基甘氨酸的合成方法，其特征在于：将权利要求1所述双功能酶生物催化剂分散在pH值为7.2-7.4的缓冲溶液中，加入环丙基羰基乙酸钾，甲酸铵和辅酶NADH，在20-60℃条件下，pH为6.0-9.0，以50～150rpm转速振荡，生物转化时间为1-18h。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：辅酶的浓度为0.1-0.3mM。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将双功能酶生物催化剂分散在缓冲溶液中，加入环丙基羰基乙酸钾，甲酸铵和辅酶NADH，辅酶的浓度为0.1-0.3mM，在20-60℃条件下，pH为6.0-9.0，以50～150rpm转速振荡，生物转化时间为1-18h；所述缓冲溶液为10mM磷酸缓冲盐溶液PBS，含NaCl 137mM，KCl2.7mM，Na₂HPO₄ 10mM，KH₂PO₄ 2mM，pH值为7.2-7.4。