[发明专利]利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法

权利要求书

1.一种利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1）携带赤霉病菌的大麦粒的制备：将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却到室温，接着向装有大麦粒的瓶中接种赤霉病菌，并在25～26℃条件下培养5～6d，期间摇动培养瓶2～3次，使大麦粒充分长满赤霉病菌；

2）纱布包裹含有赤霉菌的大麦粒:使用若干块无菌纱布分别包裹数颗已长满赤霉病菌的大麦粒，并逐份扎口系好标签；

3）大麦粒的掩埋：将每份无菌纱布包好的大麦粒掩埋在土壤下10～20cm的深度，25～30d后取出；

4）装瓶：将从土壤中取出的每个无菌纱布内包裹的大麦粒分别装入一个灭菌后的玻璃瓶内，做好标记待用；

5）培养皿制备：将每个玻璃瓶内的大麦粒取出洗净消毒后，在无菌滤纸上切开大麦粒后分装于若干培养皿内的平板培养基上培养；

6）观察经步骤5）培养3～5d后的培养皿上的染菌大麦粒菌丝发展情况，挑取红色赤霉病菌没有明显扩张的对应培养皿内的能够抑制大麦粒菌丝生长的微生物菌落进行分离培养；

7）拮抗菌的筛选：将经步骤6）挑选进行分离培养的微生物菌落挑取出来按“之”字型分别涂布于数个新的培养皿的平板培养基上，并在每个培养皿正中间放置一粒步骤1）中制取的携带有赤霉病菌的大麦粒，而后用封口膜对平板培养基边缘进行封口，于25～26℃下培养7～8d，从中选出红色赤霉病菌没有明显扩张的对应培养皿内的微生物菌落。

2.根据权利要求1所述的利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其特征在于：挑取步骤7）中筛选出的微生物菌落，按步骤7）的操作重复筛选数次，纯化得到单菌落。

3.根据权利要求2所述的利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其特征在于：其还包括步骤8）拮抗菌的二次筛选：具体地，

8.1）挑取由步骤7）筛选出的有抑菌作用的单菌落接种于灭菌的大麦粒培养瓶中，并同时接种两粒步骤1所培养的携带赤霉病菌的大麦粒，大麦粒培养瓶内的大麦粒与瓶口之间存在供菌丝向上生长的空隙，而后在大麦粒培养瓶中注入1mL的无菌水，封口后在25～26℃下培养5～7d，培养期内每天摇动玻璃瓶，最后静置1～2d观察菌丝是否得到抑制；

8.2）观察步骤8.1）中大麦粒培养瓶内的菌丝抑菌效果，挑选出红色赤霉病菌没有明显扩张的对应培养瓶内的微生物菌作为目的拮抗菌。

4.根据权利要求1所述的利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其特征在于：步骤3）中大麦粒所埋的土壤选择种植过大、小麦的田块。

5.根据权利要求1所述的利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法，其特征在于：步骤1）中高温灭菌工序为：将蒸过或煮过的大麦粒装瓶后于120～125℃下灭菌20～25min。