[发明专利]用于检测维生素D代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明提供了用于检测维生素D代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法，该引物组包括上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1‑20所示的10种引物对。利用该引物组扩增维生素D代谢基因时，可通过一次反应同时对维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR的多个外显子、内含子区域进行扩增，从而可同时检测维生素D代谢基因CYP24A1、CYP27B1和VDR的多个高频突变位点。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及用于检测维生素D代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

维生素D(Vitamin D)是一类脂溶性的维生素，是一种能维护身体健康的多功能激素，在控制体内钙磷水平和骨骼钙化上具有重要作用，而且对于骨外系统，包括心血管系统、免疫系统、神经系统、糖代谢、细胞增殖分化等方面，都具有十分重要的作用。

维生素D可以通过饮食和阳光照射而获得。维生素D本身并不具有活性形式，它需经过两步羟基化才能成为具有生物活性的物质，在人体内发挥调节血钙和血磷的功能。维生素D的吸收、转运和分解过程十分复杂，涉及到多个基因的参与。首先血液中维生素D结合蛋白(DBP)将从食物和皮肤内合成的维生素D运输至肝脏。在肝脏中，由细胞色素P450家族成员CYP2R1基因编码25-羟化酶，维生素D₃经该酶催化，即C-25发生羟基化，生成25(OH)D₃。其中，25(OH)D₃有下述两条路径。

路径1：CYP24A1编码的24-羟化酶使25(OH)D₃发生羟基化，生成24,25(OH)₂D₃，通过胆汁入肠随粪便排出。若人体内的CYP24A1发生突变，会造成维生素D的分解发生羟基化障碍，导致血钙在体内积聚而无法排出。

路径2：25(OH)D₃被DBP转运至肾脏，在CYP27B1编码的1α-羟化酶的作用下，生成1,25(OH)₂D₃。若机体内的CYP27B1发生突变，会造成维生素D合成受阻，导致血钙和血磷减少。

一方面，肾脏中的1,25(OH)₂D₃与维生素受体VDR和视黄酸X受体结合成的二聚体特异性结合，由DBP转运至骨组织，维持骨矿质化平衡。另一方面，24-羟化酶使1,25(OH)₂D₃第25碳上发生羟基化，生成1,24,25(OH)₃D₃，通过胆汁入肠以排泄的方式将其排至体外。

VDR是一种核激素受体配体诱导转录因子，主要存在于成骨细胞、破骨细胞、骨髓干细胞、肾小管上皮细胞、甲状旁腺细胞等中，它们的下游靶点主要参与钙磷的调节。基因突变可使VDR受体的锌指结构稳定性减弱，从而使VDR与1,25(OH)₂D₃的亲和力减弱，或不能与1,25(OH)₂D₃特异结合，导致受VDR受体调控的基因的启动子激活失败，进而使机体钙磷失衡。

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)已被广泛应用于医学、遗传学、微生物学乃至整个生命科学中。多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。多重PCR的检测通量高于常规PCR，因此，有必要提出用于检测维生素D代谢基因突变的引物组。

发明内容

本发明提供了用于检测维生素D代谢基因突变的引物组、试剂盒及方法，能够检测维生素D代谢基因。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：