[发明专利]一种高产法尼烯的重组菌及其构建方法与应用

说明书

一种高产法尼烯的重组菌及其构建方法与应用，属于微生物技术领域。为了进一步提高大肠杆菌合成法尼烯的产量、提升合成途径上酶的催化效率和稳定性，本发明提供了一种合成法尼烯的基因工程菌，所述基因工程菌过表达mvaE、mvaS、ERG12、ERG8、ERG19、AaIDI、ispA以及带有D18定位肽的β‑法尼烯合成酶D18‑AaFS基因。所述基因工程菌发酵96h法尼烯产量达到35.93g/L，有利于推动生物法合成法尼烯的工业化进程。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产法尼烯的重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

法尼烯(farnesene)，分子式C₁₅H₂₄，又称金合欢烯，是一种链状倍半萜烯。法尼烯因具有芳香气味和抗氧化等活性，可作为添加剂应用于日化、医药、食品等工业；还可作为信息素，应用于农业害虫的生物防治；此外，法尼烯还是合成维生素E侧链的重要中间体。近年来，萜烯类生物燃料越来越受到关注。法尼烯的加氢产物法尼烷(farnesane)因具有高十六烷值和较低的碳排放，被认为是极具潜力的航空航天领域新型生物燃料，并已通过ASTMD7566航空燃料标准的测试。

天然法尼烯存在于多种植物精油中。但是植物中法尼烯含量低，提取成本高，易受原料限制；而化学法合成法尼烯需要专门仪器设备，步骤复杂，能耗高，易产生污染。随着基因工程和合成生物学的发展，利用工程微生物来生产法尼烯已经实现。通过引入外源途径，利用大肠杆菌(Escherichia coli)合成法尼烯的产量在摇瓶水平达到5.40g/L(发酵96h)，在发酵罐水平达到8.74g/L(发酵120h)。通过改造内源途径和引入合成酶，利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)合成法尼烯的产量在20万升工业级发酵罐水平达到130g/L以上(发酵两周)。鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)仅利用二氧化碳、光照和微量元素合成法尼烯的产量达到69.1±1.8μg·L^-1·O.D.^-1·d^-1。由于法尼烯本身对常见宿主没有毒性，有望通过基因工程改造或发酵技术改进来进一步提高其产量。

细菌微区室(bacterial microcompartments,BMCs)是20世纪50年代在蓝细菌中发现的一类以蛋白质为基础的多面体亚细胞结构，它能提高底物、酶、辅助因子的浓度，产生底物通道效应，提高原核生物的代谢效率；能隔离有毒代谢产物对细胞的伤害以及外界条件变化对被包裹酶活性的影响；还能减少分支或竞争代谢途径对目的产物产量的影响。BMCs体系具有应用于合成生物学的巨大潜力。将BMCs的定位肽添加到合成途径酶的N端，能够使酶聚集或者固定化，从而提高外源途径的代谢效率。

发酵罐发酵技术也是影响目的产物产量的重要因素。例如，培养基成分(碳氮比)、搅拌转速、溶氧、温度、pH、补料成分与方式等都会影响菌体的生长、质粒的稳定性、酶的表达和活性、副产物的生成等，从而影响产物的产量。不断优化和寻找最适发酵条件，对于法尼烯产量的提高具有重要意义。

发明内容

为了进一步提高大肠杆菌合成法尼烯的产量，我们将BMCs的定位肽D18添加到法尼烯合成酶AaFS的N端，构建了合成法尼烯的重组菌；并通过发酵罐发酵技术的优化，使法尼烯产量有了显著提升。本发明采用技术方案如下：

本发明通过Gibson Assembly方法构建了pTrc-ERG12-ERG8-ERG19和pET28a-(D18-AsFS)-ispA-AaIDI两个质粒。将以上两个质粒和pACYC-mvaE-mvaS共转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得产法尼烯的重组菌。挑取单菌落进行发酵，通过IPTG诱导表达和TRPO原位萃取获得含有法尼烯的样品，通过气相色谱和法尼烯标准品曲线对样品进行定量分析。