[发明专利]一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒和方法

权利要求书

1.一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括阳性对照组、待测组和阴性对照组；

所述阳性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、JC病毒DNA和ddH₂O；

所述待测组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R和ddH₂O；

所述阴性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、和ddH₂O；

其中所述JC病毒引物序列为：

JCV-F：GGTATACACAGCTTTTGAAGCAACA；

JCV-R：CCTTCCTTTCTCCAAAACTTTTTG。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒，其特征在于：所述2×TaqMix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料。

3.一种根据权利要求1所述的用于检测尿液JC病毒的方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：

步骤一：待测样本的获取：从待测尿液中提取DNA，获得待测样本；

步骤二：PCR反应液的配置：阳性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、JC病毒DNA 2μL、ddH₂O补至50μL；待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、样本DNA 2μL、ddH₂O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、ddH₂O补至50μL；

步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数；

步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与阳性对照组大小相同的条带回收；

步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；

步骤六：与JC病毒的序列进行比对，如果一致，则指示该样品中存在JC病毒，如不一致或者样本管中无与阳性对照相同大小的条带，则指示该样品中不存在JC病毒。

4.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液JC病毒的方法，其特征在于：所述步骤三中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，20s，循环次数为40次；72℃，10min。

5.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液JC病毒的方法，其特征在于：所述步骤一从尿液中提取DNA按先后顺序依次为：

尿液样本10ml左右，5000转离心10min,收集底部的沉淀，用枪小心吸走上方的液体，底部仍保留部分液体；

加入TE缓冲液1.5ml，混匀，8000转,离心5min,收集沉淀；

将上述沉淀37℃水浴温育1h后，加入0.2ml浓度为1mg/ml蛋白酶K，然后50℃水浴3h；

拿出冷却至室温，加入等体积的饱和酚溶液，转动离心管8min，接着5000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一离心管中；

向离心管中加入等体积的氯仿﹕异戊醇(24﹕1)，上下转动混匀，5000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一离心管中；

加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，用玻璃棒挑取絮状DNA转入另一离心管中，加70％乙醇0.2ml，5000rpm离心15min，弃上清；

重复上述步骤一次：

室温放置离心管5min，然后加入20μL DEPC水溶解DNA，-20℃冰箱保存备用。