[发明专利]一种促进黄酮类物质积累的黄芪毛状根的培养方法

权利要求书

1.一种促进黄酮类物质积累的黄芪毛状根的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1.制备黄芪无菌苗

将黄芪种子用自来水浸泡20-24h后，放入70％乙醇中浸泡10-15min，用无菌水冲洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用无菌水冲洗3-5遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度15-25℃，湿度50-60％培养，获得黄芪无菌苗；所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子，或膜荚黄芪种子的一种；所述MS培养基的每升的组成如下：

大量元素：KNO₃4-6mM，Ca(NO₃)₂·4H₂O 4-6mM，MgSO₄·7H₂O 1.5-2.5mM，KH₂PO₄0.8-1.2mM，

微量元素：H₃BO₃44-48μM，MnCl₂·4H₂O 8-10μM，ZnSO₄·7H₂O 0.6-0.8μM，CuSO₄·5H₂O0.2-0.4μM，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM；

有机物质：肌醇80-100μM，蔗糖300-450μM，水解酪蛋白300-500μM；

步骤2.菌种活化和培养

将发根农杆菌加入到液体YEB培养基中于26-28℃，220-250rpm下培养至OD600值为0.5-0.6；然后，将菌液在1/2MS液体培养基中进行培养，于26-28℃下150-180rpm培养20-30min；1/2MS培养基的组成是将MS培养基中的大量元素的用量减半；1/2MS固体培养基中含有2-4％的琼脂；

步骤3.材料预培养

将步骤1中黄芪无菌苗的子叶，茎，下胚轴、叶柄切成大小0.4-0.5cm²的小块作为外植体接种至添加0.1-0.3mg/L植物激素的MS培养基上，避光培养24-48h，植物激素为IBA、NAA的一种；

步骤4.外植体和发根农杆菌的共培养

将步骤3中的外植体与步骤2中的菌液于50-60rpm，25-28℃条件下充分接触10-15min后；用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，接种到添加0.2-0.4mg/L的诱导因子的MS培养基中培养2-4天；所述诱导因子是CuCl₂、CdSe量子点、CdTe量子点的一种或两种以上；所述农杆菌菌株选自ATCC15834，ATCC11325，ACCC10060，LBA9402，R1000，R1601，A4的一种；

步骤5.毛状根的除菌诱导培养

将步骤4的外植体用无菌水冲洗后接种到含500mg/L的头孢噻肟钠(cef)的1/2MS固体培养基上于25℃下避光培养；并间隔一周更换新的培养基，同时逐渐降低头孢噻肟钠(cef)的浓度；逐步降低头孢噻肟钠(cef)的浓度是按照400mg/L、300mg/L、200mg/L、100mg/L的方式进行；

待根长度达到3cm后将其分离出来，放于含有50mg/L的头孢噻肟钠(cef)和0.6-0.8mg/L的茉莉酸甲酯的1/2MS固体培养基上，并间隔一周继代一次，继代三次后，将其放于无头孢噻肟钠(cef)的1/2MS固体培养基上培养；

步骤6.毛状根扩大培养

将步骤5的毛状根转入6,7-V液体培养基中，于25-28℃，100-130rpm下进行扩大培养，培养过程中施加蓝光，每天光照8-12h，并且每18-20天继代一次，获得大量生长的黄芪毛状根。

2.根据权利要求1所述一种促进黄酮类物质积累的黄芪毛状根的培养方法，其特征在于：所述步骤2中的液体YEB培养基的组成如下：取酵母粉1g,牛肉膏5g,蛋白胨5g,蔗糖5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g溶于1L蒸馏水中，用氢氧化钠调至pH值为7.4，121℃，高压灭菌20min。

3.根据权利要求1所述一种促进黄酮类物质积累的黄芪毛状根的培养方法，其特征在于：所述步骤6中的6,7-V液体培养基的组成和制备方法如下：

A.制备组分母液

(1)大量元素母液：每升母液含有16g KNO₃、2g(NH₄)₂SO₄、5g MgSO₄·7H₂O、3g NaH₂PO₄、4g KCl、0.4g Na₂HPO₄；

(2)CaCl2母液：每升母液含有4g CaCl₂·2H₂O

(3)微量元素母液：每升母液含有4g MnSO₄·H₂O、1.5g ZnSO₄·7H₂O、5g H₃BO₃、0.05gKI、0.25g NaMoO₄·2H₂O、0.25g CuSO₄·5H₂O、0.25g CoCl₂·6H₂O

(4)铁盐母液：每升母液含有1.86g EDTA-Na₂、1.39g FeSO₄·7H₂O

(5)维生素母液：每升母液含有0.125g烟酸、0.05g维生素B1、0.05g维生素B6、10g肌醇

B.所述6,7-V液体培养基的制备方法是：取大量元素母液50mL、CaCl₂母液50mL、微量元素母液1mL、铁盐母液10mL、维生素母液10mL、蔗糖30g；溶于1L蒸馏水调节pH值到5.8。