[发明专利]一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法

说明书

本发明公开了一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法，属于植物分子生物学领域。本发明提供的马尾松miRNA前体基因的克隆方法，分别对miRNA前体基因的PCR扩增体系和PCR反应条件进行优化，退火温度控制在64‑68℃，循环次数为34‑35次，以及改变琼脂糖凝胶电泳的胶浓度、电压和电泳时间，实现成功高效地克隆马尾松miR172和miR947前体基因。本发明方法特异性强，目的基因的产量高，在前体基因的关键成熟序列区域无碱基错配现象，获得的前体基因序列与目的基因序列同源性高达100％。有利于进一步构建植物表达载体，用于转基因植物的培育，在农林作物遗传改良和分子育种方面具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，更具体地说，涉及一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法。

背景技术

马尾松(Pinus massoniana Lamb.)为中国南方特有树种，具有分布广、适应性强、生长快、用途大等特点，在林业生产中占有重要地位，是当今建材工业、造纸工业、化纤工业、松香和松节油化学工业等主要原料。马尾松的扩大繁殖方式主要是通过有性繁殖进行，而人们大规模获取遗传改良的种子，主要是依靠马尾松种子园建设来实现的。但自1980年以来建立的众多马尾松无性系种子园，都面临着童期长，雌球花、雄球花的着生量不均衡以及花期同步性不长等问题，难以为大面积造林提供足够的优质种子。研究马尾松开花规律是良种生产研究的重要内容之一，提高花粉和种子产量，可望创造更大的经济利益。

miRNA(microRNA)是一组由基因组编码的长度约20～23个核苷酸的非编码RNA，在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNA大部分在特定的组织和发育阶段表达。miRNA的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。miRNA是经过最原始的pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即miRNA前体基因，pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长度约为20～23nt的成熟miRNA。MiR主要在转录后水平上通过介导靶基因mRNA的裂解或者抑制翻译来调节植物基因的表达，参与植物器官的形态建成、生长发育以及对外界环境胁迫的应答能力等生物学过程。随着科学研究的进一步深入，现已证明miRNA在植物开花时间调控和花器官发育过程中也起着不可替代的作用。根据本实验室测序结果，在马尾松中获得大量miRNA前体基因。之前大量研究发现miR172参与植物开花发育调控，miR172的过量表达会促进植物开花。同时miR947已在火炬松以及油松雌雄球果sRNA测序中鉴定到，可能参与松类开花发育调控过程。

目前为止，未见在马尾松中克隆miRNA前体基因的相关报道。现有技术报道了高山松miRNA前体基因的克隆方法，参见文献(张曼曼.高山松miRNA171a的功能研究，河南师范大学.)，按照现有技术公开的克隆高山松miRNA前体基因的克隆方法去克隆马尾松miRNA前体基因，克隆效果很不稳定，无法稳定地克隆目的基因，并有引物二聚体现象。且克隆到目的基因时，经连接转化挑选单克隆，摇菌后送菌液到擎科生物公司测序后，发现有碱基错配的现象。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法，用以克隆马尾松miRNA前体基因。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种马尾松miRNA前体基因的克隆方法，包括以下步骤：

1)以马尾松基因组DNA或cDNA为模板，PCR扩增获得miRNA前体基因；

2)琼脂糖凝胶电泳回收和纯化步骤1)获得的miRNA前体基因；

3)将步骤2)获得的miRNA前体基因与克隆载体连接，然后转化、筛选大肠杆菌，获得阳性菌株；

4)摇菌培养步骤3)获得的阳性菌株，回收含miRNA前体基因的载体，进行PCR检测和测序分析。