[发明专利]多杀菌素衍生物作为精氨酸代琥珀酸合成酶激活剂及其应用

权利要求书

1.多杀菌素衍生物及其在医学上可接受的盐在制备治疗与精氨琥珀酸合成酶相关的I型瓜氨酸血症药物中的应用，其特征在于，所述多杀菌素衍生物具有以下结构式：

。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述精氨琥珀酸合成酶具体为蛋白ASS1和ASS1^G362V；所述蛋白ASS1和ASS1^G362V的制备方法为：通过同源重组技术构建ASS1 pet28a质粒，后采用基因定点突变技术，构建ASS1^G362V pet28a质粒，将构建好的两种质粒分别转入大肠杆菌DH₅a中进行原核表达并纯化蛋白ASS1和ASS1^G362V。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白ASS1和ASS1^G362V的制备步骤包括：

S1、ASS1-pET-28a质粒构建

（1）提取人乳腺癌细胞系HCC1806细胞系总RNA，RT-PCR扩增ASS1基因，使用引物为（5´-3´）：

ASS1-F：ACCCTCGAGGGATCCGAATTCATGTCCAGCAAAGGCTCC(SEQ ID NO 3);

ASS1-R：AGACTGCAGGTCGACAAGCTTTTATTTGGCAGTGACCTT(SEQ ID NO 4)；

（2）提取pET-28a质粒，酶切、电泳胶回收后按同源重组的方法将ASS1基因整合到pET-28a质粒中；

（3）转化：将构建好的pET-28a质粒转化到大肠杆菌DH₅a中，筛选出阳性克隆送测序，对于测序正确的克隆扩大培养后提取质粒，转化到BL21菌株中，PCR鉴定阳性克隆，确定条带大小为1.0 -1.5kb之间，送测序；选取测序正确的菌株-80℃保菌，备用；

S2、ASS1^G362V-pET-28a表达质粒的构建

设计点突变引物，根据同源重组的原理设计突变引物：

ASS1^G362V-F：TACATCCTCGTCCGGGAGTCCCCACTGTCTCTCTACAAT (SEQ ID NO 5)；

ASS1^G362V-R：GGACTCCCGGACGAGGATGTACACCTGGCCCTTGAGGAC (SEQ ID NO 6)；

PCR扩增：使用突变引物对pET 28a-ASS1质粒进行扩增；扩增产物的Dpnl消化，去除甲基化模板质粒；进行同源重组反应，转化，测序鉴定；

S3、蛋白的表达与纯化

（1）原核表达：取出备用的ASS1 BL21菌株恢复培养至OD₆₆₀到0.4-0.6之间，加入终浓度为1 mM IPTG诱导4 h，离心收集菌液，-80℃保存备用；

（2）蛋白的提取：将-80℃保存的菌液解冻，加入Lysis buffer冲液重悬细菌，并加溶菌酶冰上放置，超声破壁，离心，取上清液，冰上待用；

（3）蛋白的纯化：在上清液中加入Ni-NTA填料，孵育后将混合物装柱，进行洗脱，收集洗脱液；

（4）蛋白的除盐和保存：将洗脱液超滤离心除盐，稀释；

（5）分装与保存：测定稀释蛋白的浓度，并分装，液氮速冻后-80℃保存。