[发明专利]一种急性T淋巴细胞白血病阿糖胞苷耐药细胞株构建方法

权利要求书

1.一种急性T淋巴细胞白血病阿糖胞苷耐药细胞株构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：急性T淋巴细胞白血病耐Ara－C细胞株Jurkat/Ara－C的培养：

A.将急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞悬浮于10％胎牛血清(Gibco公司)的RPMI－1640培养基(Hyclone公司)中，放置在温度为37℃、CO₂浓度为5％、饱和湿度的培养箱中培养；

B.拟选择0.02μg/ml的Ara－C作为起始培养浓度，将Jurkat细胞持续培养在含有0.02μg/ml Ara－C的完全培养基中，每2－3天换液，观察Jurkat细胞活力并拍照；

C.当Jurkat细胞能在0.02μg/ml Ara－C作用下稳定增殖时，逐渐提高Ara－C的浓度，反复传代培养，直至在1μg/ml的Ara－C浓度下稳定存活，即可得到急性T淋巴细胞白血病耐Ara－C细胞Jurkat/Ara－C细胞株；用CCK－8检测Jurkat/Ara－C细胞株的耐药倍数；

D.用无Ara－C的完全培养基继续培养Jurkat/Ara－C细胞株1个月，用CCK－8再次检测其耐药倍数；

S2：用CCK－8检测Jurkat/Ara－C细胞株活力：

A.收集对数生长期的Jurkat/Ara－C细胞株，调整Jurkat/Ara－C细胞株的密度为(1.5～2)×10⁵个/ml；

B.在96孔细胞培养板中每孔加入90μl的Jurkat/Ara－C细胞悬液，设实验组、对照组和空白组，实验组加入10μl不同浓度的Ara－C，对照组加入10μl无血清RPMI 1640培养基，空白组加入100μl RPMI 1640，在其边缘孔中加入100μl无菌PBS，将其放置在温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中培养。每组设3个复孔，实验独立重复3次。

C.在培养箱中培养48h后，每孔加入10μl CCK－8溶液，继续孵育4h，用全波长分光光度计于450nm处检测各孔的OD值；

D.计算各组的平均OD值，然后根据下列公式计算细胞的细胞存活率：

细胞存活率(％)＝(对照组OD值－实验组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100％；

S3：绘制细胞生长曲线：

取对数生长期的Jurkat/Ara－C细胞株，按每孔2×10⁵个细胞接种到12孔细胞培养板中，每组设置3个复孔，共铺7块培养板；

每隔24h取一块培养板，将每种Jurkat/Ara－C细胞株3个复孔分别进行计数，总共记录7天的细胞个数的数据，计算细胞平均密度；

待7天数据记录完成，用Graphpad软件进行Jurkat/Ara－C细胞株生长曲线拟合。