[发明专利]一种鉴定商业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法和引物对

说明书

本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及用于检测羊肚菌种类交配型基因MAT1‑1的引物对M1F/M1R(SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22)和用于检测羊肚菌种类交配型基因MAT1‑2的引物对M2F/M2R(SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24)，以及利用所述引物对鉴定商业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法。该方法适用于羊肚菌菌种生产过程的不同阶段，可实时监测羊肚菌菌种生产过程的交配型基因情况，保证两个交配型基因不丢失，播种前提前预测出菇能力。本发明引物对和交配型基因鉴定方法的准确率、稳定性和灵敏度高。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定商业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法和引物对。

背景技术

羊肚菌是羊肚菌属(Morchella)真菌的统称，隶属于子囊菌门(Ascomycota)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)。

真菌的“性别特征”由交配型基因位点(mating-type locus，MAT)控制，包括羊肚菌在内的多数子囊菌的交配型基因一般以MAT1-1和 MAT1-2表示。目前，商业化栽培推广的羊肚菌种类的有性生殖方式均为异种配合，即必须同时具有交配型基因MAT1-1和MAT1-2或分别含有两个互补交配型基因的菌丝体相互融合，才能完成有性生殖过程，实现出菇。

因此，在羊肚菌大规模生产、推广种植过程中，如果能够寻找一种简单、快速、有效的检测方法，对羊肚菌的整个菌种生产过程(母种、原种、栽培种)及播种前对交配型基因全程实时监测，保证在菌种生产过程两个交配型基因不丢失，提前预测其出菇能力，这对羊肚菌的大规模生产、栽培研究及保障羊肚菌产业的稳健、快速发展具有重要意义。

现有梯棱羊肚菌交配型基因的鉴定方法及特异引物对^[1]为：用于检测交配型基因MAT1-1的特异引物对P8-4F/P8-4R，用于检测交配型基因MAT1-2的特异引物P6-1F/P6-1R。现有鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型基因方法和引物对^[2]为：用于检测交配型基因MAT1-1 的特异引物对P7-2F/P7-2R或P8-5F/P8-5R，用于检测交配型基因 MAT1-2的特异引物对P10-1F/P10-2R或P10-2F/P10-3R。现有羊肚菌交配型基因决定基因鉴定专用引物及出菇能力预测方法^[3]为：用于检测交配型基因mr1MAT1-1-1基因的特异引物对 Mr1MAT1-1-1F/Mr1MAT1-1-1-R，用于检测交配型基因mr1MAT1-2-1 的特异引物对Mr1MAT1-2-1-F/Mr1MAT1-2-1-R。现有鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型基因方法^[4]为：用于检测交配型基因MAT1-1 的引物对MAT1-1L/MAT1-1R，用于检测交配型基因MAT1-2的引物对 MAT1-2L/MAT1-2R。这些引物对序列及其分析参见图1A-图1D。

引物设计的一般性原则：(1)引物与模板DNA序列紧密互补；(2)引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或者发夹结构，即引物自身不含有连续4个碱基的互补、两引物之间不应有多于4个连续互补碱基或同源碱基，尤应避免3’端的互补重叠；(3)引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应，即发生错配；(4)引物长度一般不超过38bp，常用的是18-27bp；(5)引物序列的GC含量一般为 40％-60％；(6)引物序列碱基分布具有随机性，避免出现4个以上的单一重复碱基。

基于上表对现有具体引物序列的分析并参照引物设计的一般性原则，为了满足实时监测羊肚菌菌种生产过程及播种前的交配型基因情况，进一步提高交配型基因鉴定方法的特异性、稳定性和灵敏度，对更优的引物对及其鉴定方法，一直存在迫切的需求。

发明内容