[发明专利]多重RT-PCR同时检测四种番茄病毒的方法

说明书

本发明公开了一种多重RT‑PCR同时检测四种番茄病毒的方法，属于植物病毒检测技术领域。本发明根据TMV、ToMV、ToBRFV和TSWV全基因组序列的差异设计了4对特异性引物，建立了四重RT‑PCR检测体系，其检测的特异性强，DNA扩增片段的大小适宜，不同种类的病毒所对应的扩增产物的电泳条带之间有一定的距离，多重PCR结果一目了然，容易辨认特异性条带所对应的病毒。其检测的灵敏度高，TMV、ToMV、ToBRFV或TSWV的特异性引物均可检测出0.02pg的质粒模板(对应的拷贝数为1.8×10³)以及0.2ng番茄植物样品，完全可满足常规番茄样品的检测；本发明的检测体系对指导四种病毒的早期检测和防控有积极作用。

技术领域

本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及一种多重RT-PCR同时检测四种番茄病毒的方法。

背景技术

病毒病是番茄安全生产的严重威胁。番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugosefruit virus，ToBRFV)是2015年首次报道的一种烟草花叶病毒属病毒，该病毒已经传播到美洲、亚洲和欧洲的十个国家。该病毒侵染后会在番茄果实上引起畸形、黄色斑或褐色皱缩坏死等症状，导致番茄果实丧失市场价值。2019年，ToBRFV在中国山东发生。ToBRFV非常稳定，可存活很长时间而不丧失传染力，既可以通过种子传播，也可以通过整枝打叉等农事操作传播。因此，ToBRFV对番茄安全生产具有巨大的威胁，目前尚无有效的控制手段。

烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、番茄花叶病毒(tomato mosaicvirus，ToMV)和番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus，TSWV)是侵染番茄的另外几种重要的病原物，也会对番茄产量和质量造成巨大损失。ToBRFV和TMV、ToMV都属于烟草花叶病毒属，无法利用多克隆抗体区分开，目前也没有ToBRFV的多克隆抗体。ToBRFV和TSWV在番茄果实上产生的症状难以区分，二者复合侵染会导致番茄症状加重。因此，生产上亟需一种快速、准确、易操作的方法来检测ToBRFV，同时将其与TMV、ToMV、TSWV等侵染番茄的病毒区分开。

多重PCR(multiplex PCR)技术由于可以在一个反应管中同时扩增多个序列，实现了对多重病毒的同步检测，大大节约时间、成本以及模板，逐渐被广泛用于病毒病的检测工作中。相比常规PCR，多重PCR效率高，节省了检测成本和检测时间。但没有关于同时检测TMV、ToMV、TSWV和ToBRFV这四种番茄病毒的相关文献和专利。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种多重RT-PCR同时检测四种番茄病毒的方法。采用本发明的方法可以实现同时区分TMV、ToMV、TSWV和ToBRFV这四种番茄病毒，为番茄病毒病害的早期诊断与防治提供了技术支持。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种检测番茄病毒的多重RT-PCR引物组合，所述引物组合包括：

用于特异性RT-PCR检测ToMV的引物对I，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

用于特异性RT-PCR检测ToBRFV的引物对II，其序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

用于特异性RT-PCR检测TSWV的引物对III，其序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

用于特异性RT-PCR检测TMV的引物对IV，其序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

进一步的，所述引物组合中还包括：用于特异性RT-PCR检测内参基因ubiquitin的引物对V，其序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。