[发明专利]表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法

说明书

本发明公开了一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，包括轮状病毒抗体分组、制备纳米材料，制备SERS标记检测探针，制备拉曼免疫层析试纸条及试纸条性能检测等五个步骤。一方面本发明将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，可大量用于临床快速诊断中；另一方面本发明的方法操作简便、灵敏度高，15min内即可完成检测，在轮状病毒的早期检测中具有广阔的应用和推广前景。

技术领域

本发明属于轮状病毒检测技术领域，具体涉及一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法。

背景技术

腹泻是全球公共卫生的一个重要问题，全球每年约有17亿急性肠胃炎病例，约有52.5万名5岁以下儿童因患腹泻病而死亡，是全世界儿童患病、死亡的主要原因之一。在儿童中，大多数腹泻病例与病毒感染有关，包括轮状病毒、诺如病毒、星状病毒等。其中轮状病毒感染引起的腹泻病占每年胃肠炎病例的37.5% ，每年在亚洲造成死亡人数众多，而且是全世界婴幼儿四大常见病之一。根据2009年世界卫生组织估计：每年约有450000名5岁以下儿童因轮状病毒腹泻死亡。腹泻病因的早期确诊是制定治疗方案的依据，同时也可避免用抗生素治疗病毒性腹泻，减少细菌耐药性的产生。目前常用荧光定量PCR法、ELISA法和胶体金免疫层析法检测轮状病毒，其中荧光定量PCR法灵敏度较高，但技术难度较大，耗时较长；ELISA法具有较好的特异性与重复性，但极易受到主观因素影响而造成假阳性；胶体金免疫层析法虽然快速简便但灵敏度较低，且无法进行临床定量检测。表面增强拉曼散射（surface enhanced Raman scatterimg，SERS）是一种振动光谱技术，该技术灵敏度高、特异性强，将SERS与免疫层析技术结合使当前病毒的检测的重要研究方向之一。

因此，针对这一现状，在病毒检测工作中，急需实现将SERS与免疫层析技术结合，并建立一种高灵敏度SERS-免疫层析检测新技术，以快速、定量检测儿童腹泻粪便中轮状病毒的产品及方法。

发明内容

本发明提供一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，以解决背景技术存在的问题，本发明将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，临床快速诊断中具有极大的推广和应用价值。

为实现以上技术目的，本发明提供以下技术方案：

一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，包括以下步骤：

S1，轮状病毒抗体分组，将获得的一对轮状病毒抗体所包含的轮状病毒标记抗体组和轮状病毒捕获抗体组轮状病毒抗体进行独立存放备用；

S2，制备纳米材料，首先选择S1步骤其中一个轮状病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20—35nm的Au NPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入8—12mM的DTNB，搅拌反应3—6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；最后取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5—1.5%（w/v）的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5—1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10—20分钟，得到Au/DTNB@Ag NPs，再向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5—5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料；

S3，制备SERS标记检测探针，首先向S2步骤制备的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，然后用1.5—2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入轮状病毒抗体孵育1.3—2.5h；然后加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用SERS检测探针复溶液重悬，即制备得到轮状病毒特异性SERS标记分子，然后对轮状病毒特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20—40℃恒温环境下干燥3h后，得到SERS标记的轮状病毒抗体检测探针；