[发明专利]制备冻干血小板的方法及其应用

说明书

本文提供了一种制备冻干血小板的方法，其包括：1)让血小板依次与预处理液和固定液接触；以及2)让经步骤1)处理的血小板在冻干保存液存在下冻干，其中所述预处理液包括赖氨酸和胶原；所述固定液包括戊二醛和乙醇；所述冻干保存液包括血清白蛋白、PVP和甘露醇。本文还提供了该方法制备的冻干血小板和冻干血小板的用途。本文提供的冻干血小板可在长期保存时保持血小板抗原活性，为抗筛血小板的应用及血小板抗体检测试剂盒的标准化应用提供了解决方案。

技术领域

本文涉及制备冻干血小板的方法，尤其是制备可用于血小板抗体筛查的冻干血小板的方法。

背景技术

血小板抗体是机体对血小板表面或相关抗原免疫产生的抗体，刺激血小板抗体产生的抗原可以是自身的也可以是异体的。血小板抗体有两类，一类主要是针对人类组织相容性抗原(HLA)I类抗原的抗体，即血小板表面相关抗体(PAIgG),一类是针对GP抗原的血小板特异性抗体(PB IgG)。GP抗原和HLA-I类抗原刺激机体产生同种免疫反应，导致的外源性血小板破坏使血小板寿命缩短和功能改变，是血小板输注无效的重要原因。随着输注次数及量的增加，检出血小板抗体的阳性率增高，发生输注无效及非溶血性输血反应率也增高。

准确、快速、简便地检测和鉴定出血小板抗体对血小板免疫性疾病的诊断、治疗等方面起着重要的作用。目前临床上血小板抗体检测的主要方法是以免疫学方法为主，但因为血小板表面抗原的复杂性和多样性，到目前为止没有商品化的纯抗原销售。在当前的检测中多使用血小板本身来提供抗原。目前血小板的保存存在以下问题：1、血小板在液态环境下极易发生聚集并丢失其抗原性，保存效期短；2，冻干血小板都以输注及治疗(伤口愈合)为目的的，缺乏对于血小板表面抗原的保护，在冻干过程中血小板表面抗原破坏较大，导致这类产品在血小板抗体筛查应用上存在众多问题，例如灵敏度低，阳性率低。

发明内容

一方面，本文提供了制备冻干血小板的方法，该方法包括：

1)让血小板依次与预处理液和固定液接触；以及

2)让经步骤1)处理的血小板在冻干保存液存在下冻干，

其中所述预处理液包括赖氨酸和胶原；所述固定液包括戊二醛和乙醇；所述冻干保存液包括血清白蛋白、PVP和甘露醇。

在一些实施方案中，所述预处理液还包括海藻糖、山梨醇、吐温-20和EDTA。

在一些实施方案中，所述预处理液为包括如下成分的缓冲液：海藻糖0.2-5％；1-5％赖氨酸；0.2-4％胶原；0.1-2％山梨醇；0.01-0.5％(v/v)吐温-20；以及2-30mM EDTA。

在一些实施方案中，所述预处理液的配制方法为：向每升缓冲液中加入NaCl 8g、海藻糖20g、赖氨酸25g、胶原15g、山梨醇5g、吐温-20 2mL以及EDTA 1.8g。

在一些实施方案中，所述固定液中戊二醛与乙醇的体积比为1：8。

在一些实施方案中，所述冻干保存液为包括如下成分的缓冲液：1-6％血清白蛋白、0.1-1.5％PVP、以及0.5-5％甘露醇。

在一些实施方案中，所述冻干保存液的配制方法为：向每升缓冲液中加入40g血清白蛋白、12g PVP、以及18g甘露醇。

在一些实施方案中，步骤1)包括：以所述预处理液将血小板配制为10⁸-10¹⁰个/mL的第一血小板悬液，并根据所述第一血小板悬液的体积加入1/10-1/4体积的所述固定液，在室温反应0.5-1小时。

在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤1)之前以含EDTA或柠檬酸的磷酸缓冲液对所述血小板进行清洗。

在一些实施方案中，在步骤1)和步骤2之间还包括以含EDTA或柠檬酸的磷酸缓冲液对经步骤1)处理的血小板进行清洗。