[发明专利]一种高通量筛选真核生物必需基因和生长抑制基因的方法在审
| 申请号： | 202010379323.1 | 申请日： | 2020-05-07 |
| 公开（公告）号： | CN111534577A | 公开（公告）日： | 2020-08-14 |
| 发明（设计）人： | 马三垣;常珈菘;夏庆友 | 申请（专利权）人： | 西南大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6869 | 分类号： | C12Q1/6869;C12N15/90;C12N15/85 |
| 代理公司： | 北京同恒源知识产权代理有限公司 11275 | 代理人： | 赵荣之 |
| 地址： | 400715*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 通量 筛选 生物 必需 基因 生长 抑制 方法 | ||
【权利要求书】：
1.一种高通量筛选真核生物必需基因和生长抑制基因的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建转基因系统递送的CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库；
(2)将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，构成真核生物全基因组编辑细胞文库。将该真核生物全基因组编辑细胞文库均匀分成三份，其中一份细胞直接收集后抽提基因组，一份细胞用完全培养基培养1个月，另一份细胞用完全培养基培养2个月，然后收集细胞并且抽提基因组；
(3)分别在步骤(1)所得载体文库的U6启动子部分和sgRNA scaffold部分设计正向引物和反向引物，然后分别以步骤(2)收集的三组细胞基因组全部作为模板，扩增sgRNA片段；
(4)将步骤(3)扩增的三组sgRNA片段分别进行高通量测序，统计sgRNA丰度，分析必需基因和生长抑制基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：
(1-1)设计打靶位点，每个基因设计6个左右的打靶位点，并且用DNA芯片的方式合成包含打靶位点的单链寡核苷酸库；
(1-2)将所得单链寡核苷酸库克隆到转基因系统介导的基因编辑载体，构建得到基因编辑载体库。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，在p-value0.05的条件下，sgRNA消耗的基因为必需基因，sgRNA富集的基因为生长抑制基因。
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