[发明专利]一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法

权利要求书

1.一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建转基因系统递送的真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库；

(2)将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库；

(3)将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用含有农药的培养基培养作为实验组，另一份用不含农药的培养基培养作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA；

(4)以步骤(3)抽提的全部基因组作为模板，设计引物扩增各组细胞的sgRNA片段，执行高通量测序，统计sgRNA丰度，筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因，靶点基因的筛选标准为p-value0.05。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真核生物为家蚕、果蝇、人，所述农药为有机磷类农药、生物碱类农药、菊酯类农药、生物源农药等。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：

(1-1)设计打靶位点，每个基因设计6个左右的打靶位点，并且用DNA芯片的方式合成包含打靶位点的单链寡核苷酸库；

(1-2)将所得单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，整合方式包括慢病毒系统，转座子系统，位点特异性核酸酶系统等，得到一种CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用用含有农药的培养基培养，直至细胞数量降低至5％，另一份用不含农药的培养基培养相同时间作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，与对照组相比，实验组sgRNA富集或消耗的基因即为真核生物细胞与农药互作的候选靶点基因。