[发明专利]基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品及其制备方法

权利要求书

1.本发明提供一种基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品，其特征在于，用于全方位监测三体综合征基因检测的过程。

2.本发明提供一种基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

(1)利用CRISPR-Cas9技术对13、18、21三体综合征患者来源的外周血淋巴细胞进行端粒酶TERT基因的敲入表达，构建可稳定扩增分裂的基因编辑淋巴细胞；

(2)构建全新类器官培养体系，应用步骤(1)中编辑后淋巴细胞进行大规模扩增，并通过染色体核型分析验证扩增细胞染色体畸变状态的维持情况；

(3)应用步骤(2)中扩增淋巴细胞与健康人来源淋巴细胞按照特定比例混合，精确定量验证后制得基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品。

3.根据权利要求2所述的基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(1)中TERT基因敲入表达的具体步骤为：

根据TERT基因全长域设计3对特异性引物，扩增相关片段产物全长可覆盖全部TERT基因CDS区域，完成扩增后的三部分序列整合进入单一的Puro表达质粒中，并且在两段分别插入带有800bp同源臂的表达供者质粒，分别向受体淋巴细胞导入CRISPR-Cas9和供者序列，构建可稳定扩增分裂的基因编辑淋巴细胞。

4.根据权利要求2所述的基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：

(2-1)编辑后淋巴细胞的准备

对步骤(1)完成CRISPR-Cas9 TERT敲入表达编辑后的淋巴细胞留样保种后，取一定量细胞通过流式细胞术、PI染色、以及CCK-8实验检测细胞凋亡与增殖活性，确定细胞处于较好的增殖状态后，计数细胞并使用无血清DMEM培养液将细胞重悬至2×10⁶个细胞/ml，体积为100μl；之后使用原始浓度的MatriGel基质胶100μl与前述细胞悬液按照体积比1:1的比例进行混匀，置于冰上备用，完成细胞准备；

(2-2)三体综合征淋巴细胞的类器官培养

以步骤(2-1)中MatriGel细胞混悬物为基础，每200微升为一单位，滴加至24孔培养板，并置于37℃环境促ECM交联凝固；按照规定的配制改良的淋巴细胞类器官培养液，待细胞悬液凝固后，加至24孔培养板，每孔1毫升，置于37℃培养箱进行培养。

5.根据权利要求2所述的基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的制备方法，其特征在于，步骤(3)的具体步骤为：

(3-1)将步骤(2)中类器官培养扩增后的三体综合征患者来源淋巴细胞使用活细胞计数仪进行活性测定后，精准定量；

(3-2)之后与健康人来源淋巴细胞按照特定比例混合1:10³，1:10⁴，1:10⁵，1:10⁶，1:10⁷，添加细胞保存液后制得不同浓度梯度的基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品。

6.一种利用权利要求2-5中任一项所述的制备方法制备的基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的准确性鉴定方法，其特征在于，实验步骤为：使用数字PCR技术对不同比例质控产品进行检测，综合上述检测结果，鉴定基于CRSIPR-Cas9与类器官培养的三体综合征基因核酸检测质控品的准确性。