[发明专利]一种根据精浆mRNA预测无精子症者睾丸中有无精子的方法

权利要求书

1.一种根据精浆mRNA预测无精子症者睾丸中有无精子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)精液标本收集及处理：收集无精子症患者精液，液氮冷冻保存；无精子症定义为每隔4～5周取一次精液，三次精液离心后镜检未发现精子；将收集到的无精子症患者精液进行两次低速离心后上清用于RNA测序；

(2)RNA的分离和测序：应用mirVana miRNA分离试剂盒可以将大片段和小片段RNA分离，分离后应用Bioanalyer2100(Agilent)分析RNA的质量、大小分布和数量；

(3)睾丸多点穿刺活检：采用睾丸多点穿刺法，通过睾丸精子抽吸术获取无精子症患者睾丸中的成熟精子，根据倒置显微镜下是否找到成熟精子；而后以病理组织学检查为金标准，将样本分为有镜子组和无精子组；

(4)无精子症患者精浆mRNA的差异表达谱：应用睾丸多点活检病理检测无精子症患者睾丸内是否存在单倍体精子细胞，将无精子症患者样本分为睾丸有精子组和睾丸无精子组；将两组精液解冻、低速离心，将精液上清和精子细胞分离，精液上清再低速离心一次，收获的上清用于测序获得纯的精液RNA序列；再与每个患者的RNA测序结果、现有RNA文库比较，获得具有预测价值的差异表达的RNA；

(5)生物信息学分析：应用TCF注释途径注释内源性和外源性mRNA；应用lncRNA注释途径注释mRNA；

(6)验证特异性RNA预测指标的敏感性、特异性：应用real-time PCR检测各组具有预测价值的RNA表达水平；应用SPSS软件，对实验数据采用方差分析、Kruskal-Wallis H检验和Mann-whitney U检验，取α＝0.05为检验水准，采用受试者工作特征曲线法，通过计算ROC曲线下面积分析评价检测指标的敏感性、特异性；

(7)从测序结果中筛选出多个可用于预测睾丸内是否存在单倍体精子的基因；对于具体标本通过测序比对无精子症患者精液中是否含有相应基因以预测睾丸内是否存在单倍体精子。

2.如权利要求1所述的根据精浆mRNA预测无精子症者睾丸中有无精子的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，睾丸多点穿刺活检包括如下具体步骤：

患者取仰卧位，常规消毒手术区域、铺无菌洞巾，1％利多卡因行精索内神经阻滞麻醉；

用一次性20ml溶药空针(针头带侧孔)作为穿刺针；左手三指法固定术侧睾丸紧贴于阴囊皮下，穿刺部位取睾丸中上部，穿刺点用1％利多卡因局麻，利用5号半针头注射器穿刺阴囊直至睾丸白膜做一入路，右手握持穿刺用溶药空针沿入路经皮肤穿刺进入睾丸实质内，反复抽拉针栓数次，然后将针栓拉至20ml位置形成负压，保持负压状态下拔出针头。

将抽吸到的睾丸组织分为两份，一部分置入含有HTF液的小培养皿，使用1ml注射器针头分离、划破、撕碎和挤压睾丸组织，以释放生精细胞和精子制成细胞悬液，在倒置显微镜下寻找成熟精子；如有精子，结束手术；

若术侧睾丸组织无精子，可进行同侧第2次穿刺，如仍无精子，改行对侧TESE根据倒置显微镜下是否找到成熟精子；

术毕把另外一部分Bouin液固定的睾丸组织送病理，常规HE染色，由病理科医师施行病理组织学检查，以病理组织学检查为金标准，将样本分为有镜子组和无精子组。

3.如权利要求1所述的根据精浆mRNA预测无精子症者睾丸中有无精子的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，由于冷冻精液中含有保护剂等外源性RNA污染，须将冷冻保护剂单独测序，获得的序列，从实验结果中去除，即可获得纯的精液RNA序列。

4.如权利要求1所述的根据精浆mRNA预测无精子症者睾丸中有无精子的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，低速离心是指2000g离心。

5.如权利要求1所述的根据精浆mRNA预测无精子症者睾丸中有无精子的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，相关基因的预测规则为：

(1)精桨中TDRP7-2和PRM2 mRNA表达下降可以区分正常和生精阻滞病理类型；

(2)精桨中SMCP和ACSBG2-2 mRNA表达下降可以区分正常和梗阻、非梗阻性无精子症病理类型；

(3)精桨中ARID5B-3和FRS2-2 mRNA表达下降可以区分正常和唯支持细胞综合征病理类型。