[发明专利]一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法

说明书

一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法，属于微生物和酶工程技术领域。本发明采用两种特殊试剂对巴斯德毕赤酵母突变株处理，首先将重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK‑BdP5 WB138与10×试剂D反应，随后在冰水中放置，再加入10×试剂E反应。离心收集细胞后用柠檬酸缓冲液悬浮细胞进行超声波破碎。经过两种试剂处理的细胞经超声波处理6 min就将细胞全部破碎，破碎液中酶活保留在85%以上。使用本发明所提供的方法及专用处理液可以大幅度减少细胞破碎所需要消耗的电力等成本，减少设备占用时间。

技术领域

本发明涉及一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法，具体采用两种特殊试剂对巴斯德毕赤酵母突变株处理，属于微生物和酶工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶（pullulanase）专一性水解淀粉分子的1,6-糖苷键，在淀粉糖生产的糖化工艺中有广泛的应用。本课题组在前期工作中构建了一株高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母，进一步通过诱变育种获得了一株在酸性条件下高产普鲁兰酶的突变株：巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138[详见：王兵波, 沈微, 钱灵紫等. 一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达. 食品与发酵工业，2016, 42(7): 9-15；德青美朵，朱新文，解修兵，毛岸，沈微，陈献忠，樊游等“一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体”，专利申请号：201710825655.6]。

采用上述巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138（以下简称WB138）发酵制取普鲁兰酶时可以在pH4.0的酸性条件进行发酵，不容易发生染菌问题，发酵水平也比较高。但这株菌发酵得到的普鲁兰酶是胞内酶，最后需要通过细胞破碎才能得到可以使用的产品。毕赤酵母具有坚固的细胞壁，细胞破碎有一定的困难，采用超声波方法破碎时一般需要进行30 min左右才能将细胞完全破碎。采用可以裂解酵母细胞壁的酶可以降低细胞壁强度，有利于酵母的破壁。蜗牛酶、酵母溶壁酶（Zymolyase）等经常被用于酵母细胞破壁以提取酵母胞内蛋白，但这些酶价格较高，一般只能用于实验研究难以用于工业酶制剂的生产。

本发明公开一种采用价格低廉的食品工业用酶制剂对巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138细胞进行预处理的方法，经过处理的细胞更容易破碎同时得到的酶液也基本稳定。

发明内容

本发明的目的是，克服上述不足之处，提供一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法，处理后的细胞更容易被破碎，提取得到的普鲁兰酶比较稳定。

本发明的技术方案，一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法，在重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK-BdP5 WB138发酵终点，离心收集细胞，用水悬浮细胞，先后用两种试剂对细胞进行前处理，再进行细胞破碎。

上述重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK-BdP5 WB138公开于申请号201710825655.6，发明名称：一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体，（德青美朵，朱新文，解修兵，毛岸，沈微，陈献忠，樊游）。

具体步骤如下：

（1）对重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK-BdP5 WB138进行发酵，在发酵终点以5000r/min离心2min收集细胞，所获细胞用水悬浮，悬浮液体积控制为原发酵液体积的0.8倍；

（2）在步骤（1）细胞悬液中加入原发酵液1/10体积的10×试剂D，混合后在45℃下反应15min；随后将细胞悬液放入冰水混合物中使悬液迅速冷却，维持10min，再在4℃放置3h；

（3）在步骤（2）所得反应液中继续加入步骤（1）所得原发酵液1/10体积的10×试剂E，混合，随后在60℃反应20min；