[发明专利]一种血孢子虫定量检测的方法

说明书

本发明提供了一种检测血孢子虫感染强度的引物、包含该引物的产品，及其在制备检测血孢子虫是否存在及含量的产品或制备诊断血孢子虫感染导致的疾病的产品中的应用。本发明还公开了血孢子虫定量检测的方法，采用该方法检测血孢子虫感染强度，无需标准品做对照，步骤简单，且其结果灵敏度高、稳定性强。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测血孢子虫感染强度的引物以及包含该引物的产品，还涉及一种血孢子虫定量检测的方法，包括微滴化处理，然后采用特异性引物PCR扩增所述的微滴。

背景技术

血孢子虫是原生生物孢子纲的一个重要类群，寄生生存，虫体呈圆形、环形、梨形等。鸟类易感染血孢子虫，主要通过蚊蚋等昆虫传播，危害极大，死亡率很高。因此及时有效的检测出其感染的强度，至关重要。

目前对鸟类血孢子虫的定量研究技术主要有镜检法和实时荧光定量PCR方法。镜检法即在显微镜下目视检测血涂片，并对被感染的红细胞计数。血涂片的制作方法简单且花费少，可根据不同时期的形态学特征识别虫体。但存在耗时多、对血涂片质量和检测人员技术水平要求高和无法精确鉴别近缘种等缺点(参见参考文献：Valkiūnas,G.,et al.,Acomparative analysis of microscopy and PCR-based detection methods for bloodparasites,J.Parasitol,94,1395-1401,2008)。此外，镜检法灵敏度较低，往往检测不到处于慢性感染期的血孢子虫(参见参考文献：Ishtiaq,F.,et al.,Estimating prevalenceof avian haemosporidians in natural populations:a comparative study onscreening protocols.Parasites Vectors 10,127,2017)。实时荧光定量PCR(qPCR)方法与镜检法相比，具有特异性强、用时更短、效率更高等特点，目前已得到广泛的应用(参见参考文献：Asghar,M.,et al.,Are chronic avian haemosporidian infections costly inwild birds,J.Avian Biol.42,530-537,2011)。但需依赖标准品才能对样品进行定量，同时受扩增效率的影响较大，不同反应间的检测结果一致性不足，影响了感染强度检测的准确性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种通用性的绝对定量检测血孢子虫感染强度的方法，其包括微滴化处理，利用油包水技术将其“分割”为数万个纳米级的微滴，各为一个独立的反应体系，然后采用特异性引物进行PCR扩增，摆脱了标准品的依赖，同时灵敏度高、稳定性强，尤其对于慢性感染期的血孢子虫也可以明确的检测出来。具体的：

本发明提供了一种检测血孢子虫感染强度的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种检测血孢子虫感染强度的产品，所述的产品中包含如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的引物。

优选的，所述的产品中还包含微滴生成油。

进一步优选的，所述的产品还包含探针。

进一步优选的，所述的产品还包括96孔板、微滴生成卡或铝箔热封膜等等。

进一步优选的，所述的产品中还包括DNA提取所用试剂、测定DNA浓度的试剂、PCR扩增所需试剂等。

本发明进一步提供了一种如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物或包含所述的引物的产品在制备检测血孢子虫是否存在及含量的产品中的应用。

本发明进一步提供了一种如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物或包含所述的引物的产品在制备诊断血孢子虫感染导致的疾病的产品中的应用。