[发明专利]一种shRNA及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种shRNA及其应用。本发明的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供一种包含编码所述的shRNA的DNA片段的表达载体，包含该表达载体的细胞、包含所述的shRNA的细胞和药物，及其它们在抑制PEDV的M基因表达和制备治疗PEDV的药物中的应用。本发明的shRNA表达质粒安全无毒，能显著抑制猪流行性腹泻病毒的复制，使得PEDV的M基因表达抑制，具有广阔应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种shRNA及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻(PED)是一种以急性肠炎、呕吐和严重水样腹泻为特征的破坏性疾病，传染性极强。给生猪产业带来巨大的威胁和巨大的经济损失。PEDV的M基因在各种毒株之间保守性较高，全长681bp，分子量为27ku-32ku。作为组成病毒的表面结构蛋白，在病毒组装过程中发挥着非常重要的功能。有研究表明，M蛋白可以与M蛋白自身、N蛋白以及S蛋白相互作用。在感染PEDV的细胞中，病毒的M基因呈高表达，且对病毒的复制起着非常重要的作用。

RNA干扰在抵抗病毒入侵过程中起着十分重要的作用。基因沉默机制通常为小干扰RNA或者短发夹RNA诱导实现靶mRNA降解，或者由小RNA抑制特定mRNA翻译。通过设计干扰RNA来抑制PEDV是一种值得研究的技术手段。

发明内容

本发明设计了一种沉默PEDV的M蛋白对应的基因的重组shRNA干扰质粒，以抑制猪流行性腹泻病毒的复制增殖。解决现有技术中猪流行性腹泻病毒变异多、增殖快、防疫困难的问题。

本发明以猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因(NCBI上下载，GenBank:EU302820.1)作为靶序列，根据shRNA设计的一般原则进行设计，获得多对基于miR30骨架的shRNA序列，人工合成干扰片段，与pPRIME-CMV-Neo-FF3载体连接，构建重组质粒pPRIME-CMV-Neo-PEDV-shRNA-M。并从细胞水平验证其干扰效果，从中筛选出可使M基因沉默的本发明的优势shRNA序列。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体地，该shRNA的DNA序列如下：

正义链，如SEQ ID NO.1所示：

5’TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCTGGCGTACAGGTAAGTCAATTTAGTGAAGCCACAGATGTAAATTGACTTACCTGTACGCCATTGCCTACTGCCTCGG 3’；

其中，从5’端至3’端依次为XhoI酶切位点(TCGAG)、前导序列(AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGC)、短反向重复序列的正义链(TGGCGTACAGGTAAGTCAATT)、loop结构(TAGTGAAGCCACAGATGTA)、短反向重复序列的反义链(AATTGACTTACCTGTACGCCA)、后导序列(TTGCCTACTGCCTCG)和EcoRI酶切位点(G)。

反义链，如SEQ ID NO.2所示：

5’AATTCCGAGGCAGTAGGCAATGGCGTACAGGTAAGTCAATTTACATCTGTGGCTTCACTAAATTGACTTACCTGTACGCCAGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTTC 3’；