[发明专利]副溶血弧菌O抗原血清型特异检测引物及多重PCR检测方法

说明书

本发明提供了用于检测副溶血弧菌全部13个O抗原血清型的特异寡核苷酸序列及其应用，所述寡核苷酸包括：（1）副溶血弧菌全部13个O抗原血清型各自的特异基因中分别选取的2段DNA片段，如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24所示。本发明还建立了一套利用上述寡核苷酸，检测副溶血弧菌全部13个O抗原血清型的多重PCR检测系统及检测方法，首次建立了利用分子生物学手段对全部O抗原血清型的副溶血弧菌进行检测的技术，对于这一重要致病菌的临床鉴定和流行病学监测具有重要意义。

技术领域

本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及一种多重PCR的检测方法及其应用，尤其涉及一种可同时检测副溶血弧菌全部13个O抗原血清型的多重PCR技术及其所用的引物序列。

背景技术

副溶血弧菌是一种嗜盐的革兰氏阴性杆菌，常在海洋的近岸区域和河口地区被分离到，也是多种贝类生物的寄生菌。副溶血弧菌造成的食物中毒于上世纪50年代在日本首先被报道，该事件引起了270余人的食物中毒。之后，该细菌在世界上各大洲都被陆续分离到，并和多起食物中毒现象密切相关。在我国的广东、上海等沿海地区，常年都能分离到副溶血弧菌。因此，对于副溶血弧菌的快速检测和溯源，在食品安全领域具有重要意义。

细菌的血清型与致病性密切相关，同一种内不同血清型细菌的致病性往往存在着很大差异。血清学分型自上世纪30年代开始被广泛使用，至今已有超过80年的历史，可在种/属内将细菌进一步分类，是一种重要的细菌鉴定方法，目前，血清学鉴定方法是使用最为普遍的致病菌鉴定和溯源方法。传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：1）建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长；2）抗血清的生产和质控较为困难；3）很多抗血清国际上只有少数几家单位生产和保存，且用于鉴定的抗血清严重不全；4）血清学鉴定的实验过程耗时较长（2-6天）。上述缺陷严重限制了致病菌早期诊断的效率，难以满足公共卫生安全应急处理和传染病追踪溯源的需求。

细菌表面多糖抗原主要包括O多糖（O抗原）、普通抗原（CA）、胞外多糖抗原、芽孢、以及荚膜多糖（K抗原）等。基于上述表面多糖抗原的多样性，细菌可被分为不同的血清型。同一细菌不同血清型的O抗原多样性，是由于编码合成O抗原的各种酶的基因的遗传多样性决定的，这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点，被称作O抗原基因簇。副溶血弧菌的O抗原基因簇均位于dgkA和gmhD基因之间，根据其O抗原的多样性，副溶血弧菌可以分为13个O抗原血清型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对副溶血弧菌全部13个O抗原血清型的多重PCR快速检测技术，为这种致病菌的快速检测和血清型分型提供有效的技术手段。

涉及一种可同时检测副溶血弧菌全部13个O抗原血清型的所应用的PCR引物序列及多重PCR检测方法。所述的PCR引物序列包括：

分别从副溶血弧菌O1型wvaG基因、O2型wvaR基因、O3/O13型VP205基因，O4型orf16基因，O5型wvcA基因、O6型wvcJ基因、O7型wvcN基因、O8型wvdG基因、O9型wvdH基因、O10型wvcP基因、O11型wvdB基因和O12型wvcP基因中各自选取的2段DNA片段，如SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:24。

上述SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列如下：

SEQ ID (5'-3')