[发明专利]一种混合细胞与仿真细胞培养人工巢装置中生产表皮生长因子的方法

权利要求书

1.一种混合细胞与仿真细胞培养人工巢装置中生产表皮生长因子的方法，其特征在于，该方法的步骤如下：

S1.配制混合细胞培养液和细胞营养液；

S2.设置人工巢装置的参数；

S3.将混合细胞培养液装载到仿真人工巢内，启动循环装置进行细胞培养；

S4.由收集到的细胞上清液使用ELISA试剂盒进行细胞因子检测。

2.根据权利要求1所述的一种混合细胞与仿真细胞培养人工巢装置中生产表皮生长因子的方法，其特征在于，步骤S1中的混合细胞培养液由以下体积百分比的细胞组成，60-80％的人成纤维细胞、体积百分比均为1％的肥大细胞、巨噬细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞和噬色素细胞、0.5％的表皮干细胞、0.005％的CD4+T细胞、0.01％的CD8+T细胞，其中细胞密度为1×10⁷/mL，不足部分以细胞营养液补足。

3.根据权利要求2所述的一种混合细胞与仿真细胞培养人工巢装置中生产表皮生长因子的方法，其特征在于，细胞营养液包括以下成分：50ng/L的血管紧张素、98μg/L的醛固醇、66pg/L的B型脑钠肽、2.26nmol/L的地高辛、55μg/L的透明质酸、28μg/L的层黏蛋白、56μg/L的IV型胶原、75μg/L的Ⅲ型前胶原肽、10.2nmol/L的叶酸、396pmol/L的维生素B12、3mmol/L的葡萄糖、136mmol/L的钠离子、5mmol/L的钾离子、1mmol/L的镁离子、2.2mmol/L的钙离子。

4.根据权利要求3所述的一种混合细胞与仿真细胞培养人工巢装置中生产表皮生长因子的方法，其特征在于，细胞营养液还包括10ng/L的丹参、5ng/L的槲皮素。

5.根据权利要求1所述的一种混合细胞与仿真细胞培养人工巢装置中生产表皮生长因子的方法，其特征在于，步骤S2中人工巢装置的参数为：压力90-220mmHg、pH7.35-7.45、温度为36.2-37.5℃、含氧量15～50mL/100mL培养液、含二氧化碳量30～80mL/100mL培养液。

6.根据权利要求1所述的一种混合细胞与仿真细胞培养人工巢装置中生产表皮生长因子的方法，其特征在于，步骤S3中人工巢装置运行步骤如下：

S3.1设备运行前的脾区(5)无营养液，肝区(3)的第一控制阀门(8)打开使营养液(26)从胃区(7)主动向脾区(5)输送并到达脾区(5)液位的最低设定值，在心区(2)动力驱动下，营养液到达心区(2)进入到肺区(4)，营养液在肺区(4)接收来自气体透过膜(17)的氧气与二氧化碳后进入到人工巢(1)，为包裹在仿真细胞外基质中的细胞提供营养与氧气；气体交换由第二蠕动泵(9)与第二控制阀门(10)协同提供动力，氧气与二氧化碳由无菌空气(25)提供；

S3.2营养液再通过第三控制阀门(11)从人工巢(1)流出并进入到脾区(5)；

S3.3脾区(5)内营养液一部分与来自肝区(3)的营养液(26)一起进入心区(2)，再经过肺区(4)后进入干细胞巢(1)为干细胞供给营养与氧气；另一部分经过第三蠕动泵(12)驱动进入到肾区(6)并经过第四控制阀门(13)返回脾区(5)；透析液(14)经过第四蠕动泵(15)进入肾区(6)，再经过第五控制阀门(16)排出；

S3.4控制平台(20)可以从云数据中心(19)获取相关指令控制细胞培养，同时也把细胞培养数据上传云数据中心(19)；控制平台(20)同时负责为细胞生长提供未来应用细胞的患者生命场(21)；体系的培养温度由恒温系统(22)维持，系统状态由传感器(23)监控，通过数据接口(24)与控制平台(20)连接。

7.根据权利要求1所述的一种混合细胞与仿真细胞培养人工巢装置中生产表皮生长因子的方法，其特征在于，步骤S4的检测步骤如下：取出酶标板，依次加入200μL标准品，样品在微孔中25℃孵育1h；洗3次板之后每个孔加入底物200μL；25℃背光孵育20min；每个孔加入50μL终止液使反应终止，然后用全自动酶标仪检测，每份样本3个重复取平均值。