[发明专利]一种血清中胆汁酸的富集方法

说明书

本发明涉及一种血清中胆汁酸的富集方法，包括如下步骤：血清样品经过一定的预处理，然后经过填装特异性富集净化材料的固相萃取(SPE)小柱，通过优化制备过程中所用溶剂的配比及用量，得到富集净化的样品洗脱溶液，进行高效液相色谱‑串联质谱检测分析。特异性净化材料是以硅胶为基质键合极性修饰苯基填料，利用苯基键合相与胆汁酸的甾体多元环平面疏水作用及n‑π作用，极性基团与胆汁酸的极性部分发生氢键和静电作用，来实现对血清中多种胆汁酸的特异性富集净化。本发明操作过程简单，样本处理干净，高效液相色谱‑串联质谱检测灵敏度高，选择性好，定量准确，具有广阔的应用价值。

技术领域

本发明属于临床质谱检测领域，具体地说是一种检测血清中胆汁酸的富集方法。

技术背景

胆汁酸由胆固醇代谢产生，根据合成途径，可以分为由胆固醇为原料直接合成的初级胆汁酸和代谢产生的次级胆汁酸。胆汁酸是胆汁的重要组成成分，是人体脂肪代谢的必须物质。胆汁酸不仅能够调节葡萄糖和脂代谢，还能与肠道菌群相互作用，具有重要的临床意义。正常情况下，大部分的胆汁酸都参与肠肝循环，体循环和尿液中含量很低，然而当出现肝胆疾病而致使胆汁酸摄取、分泌、运转功能受损时，肝内、血液以及尿液中胆汁酸水平显著升高。因此，胆汁酸浓度的升高可作为肝脏疾病的指标。近年来的研究发现，胆汁酸也具有细胞毒性，当胆汁酸在体内超过正常水平时，会引起肝损伤，胆汁淤积症，严重可诱发肝癌。然而，由于不同亚型的胆汁酸的毒性与其生化特征有关，使其在临床上具有不同的诊断意义，因此检测每一种亚型的胆汁酸在体内水平而非简单地定量测量总胆汁酸水平，对于肝胆和肠道疾病的筛查、诊断和鉴别诊断具有重要意义。

目前临床上主要开展胆汁酸的检测方法包括电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱联用法，以及液相色谱-串联质谱法等。电化学检测法只能测定总胆汁酸量，而不能分别测定每一种亚型胆汁酸。气相色谱法及气相色谱与质谱联用技术需要将样品进行衍生化、前处理耗时烦琐。高效液相色谱串联紫外检测器在检测复杂生物基质中的胆汁酸会导致灵敏度和特异性不足。液相色谱-串联质谱法利用液相色谱的高分离能力及质谱的高分辨能力，使得该方法应用范围广，灵敏度高、专属性强、能提供相对分子质量和结构信息，可同时检测不同亚型的胆汁酸，且在较高的准确度和精密度的前提下，能够实现分析时间短、高通量的检测。

普通的液相色谱-串联质谱检测血清中的胆汁酸时，其血清前处理多采用简单的甲醇或乙腈等有机试剂沉淀蛋白后取上清液直接进样分析，或上清液经吹干复溶后进样分析，血清样品中基质干扰较大，对色谱柱及质谱污染较为严重，大大降低了质谱检测的灵敏度。因此本发明针对胆汁酸的结构特点，设计开发一种对胆汁酸特异性的富集净化的固相萃取填料，当样品通过填装该特异性固相萃取填料的固相萃取柱时，胆汁酸被特异性保留，其他组分则透过吸附剂流出小柱，最后通过较强的洗脱液选择性的将胆汁酸洗脱下来，以达到富集纯化胆汁酸的目的，用于下一步的液相色谱串联质谱检测分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种对血清中胆汁酸的富集方法和检测方法。特异性固相萃取材料是以硅胶为基质键合极性修饰苯基填料，利用苯基键合相与胆汁酸的甾体多元环平面疏水作用及n-π作用，极性基团与胆汁酸的极性部分发生氢键和静电作用，对血清中的胆汁酸进行特异性的富集净化，去除血清中基质的干扰，以实现简单、高效的前处理过程，并进行液相色谱-串联质谱的高灵敏度，高选择性，高准确性的检测。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种对血清中胆汁酸的富集方法和检测方法，包括如下步骤：

(1)血清样本预处理：取血清样品置于EP管中，加入同位素内标，混匀，加入与血清一定体积比的稀释液进行稀释血清，混匀；

(2)固相萃取柱的填装：将特异性固相萃取材料填装于柱管内；

(3)固相萃取过程：对步骤(2)所述固相萃取柱进行活化，平衡，上样，淋洗，洗脱，最后收集所有洗脱液；