[发明专利]牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用

说明书

本发明属于动物传染病防治技术领域，涉及到一种牛支原体基因突变株，尤其是一种编码分泌性假想脂蛋白的牛支原体Mbov_0145基因突变株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020081，所述Mbov_0145基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。本发明的突变株对宿主细胞的黏附能力减弱，诱导细胞因子IL‑8的能力降低，有作为毒力致弱菌株在制备牛支原体疫苗中发挥价值的潜力。

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，涉及到一种牛支原体基因突变株，尤其是一种编码分泌性假想脂蛋白的牛支原体Mbov_0145基因突变株，本发明还涉及该突变株作为毒力致弱菌株在制备牛支原体疫苗中的应用。

背景技术

牛支原体是致牛呼吸道疾病综合征的重要病原，常在运输应激后爆发，引起牛肺炎、乳腺炎、关节炎、中耳炎等病症(Arcangioli et al 2008)。目前，牛支原体病在世界范围内广泛流行，是危害国内外养牛业的重要传染病。在欧洲，由牛支原体引起的呼吸道疾病约占牛呼吸道疾病总量的25％～35％，引起的经济损失高达5.76亿欧元(Nicholas andAyling 2003)。我国于1983年首次在牛乳房炎病例中分离到牛支原体，2008年由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原室首次在牛肺炎病例中分离到该病原(石磊，等2008)。报道显示，牛支原体病常常与跨省和地区的动物贸易有关，初生犊牛主要通过吸吮患牛支原体乳腺炎母牛的母乳而被感染，临床症状主要以坏死性肺炎为特征，并继发其它细菌和病毒疾病而造成混合感染(郭爱珍2011)。由于缺乏特效抗生素和特异性疫苗，再加上病原表面可变蛋白的高频率变异性引起的牛支原体免疫逃避(Nussbaum et al2002)，导致牛支原体病的预防和治疗变得更加困难。

病原分泌蛋白是一种优先或全面接触宿主细胞的重要蛋白，是诱导致病和免疫反应的重要组分，通常被认为是病原重要毒力因子，调控病原微生物的致病过程。近来研究发现，在支原体中也存在可释放至胞外环境的分泌蛋白，如人型支原体的膜表面蛋白P80通过切割信号肽分泌至胞外，是一种重要的分泌性抗原(Hopfe et al 2004)。另外，在猪肺炎支原体的分泌蛋白组中也发现了15个与毒力相关的重要分泌蛋白(Paes et al2017)，提示支原体的分泌蛋白可能是与致病相关的潜在毒力因子。

课题组前期结合生物信息预测以及Label-free蛋白组学技术在牛支原体强、弱菌株比较分泌蛋白组学中共鉴定到69个差异表达蛋白，其中一种假想脂蛋白MbovP0145为强毒株显著上调表达，经证实该蛋白具有分泌能力和免疫原性。基于牛支原体转座子测序，申请人从牛支原体突变体库中鉴定到了MbovP0145缺陷突变体，利用细胞黏附和细胞因子表达等支原体毒力表型测定方法，发现MbovP0145缺陷突变体表现为黏附减弱，诱导细胞因子IL-8的水平显著降低，证明该突变株毒力致弱，具有作为牛支原体候选疫苗的潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一株重要的牛支原体Mbov_0145基因突变菌株以及该菌株在制备牛支原体疫苗中的用途。其缺失的MbovP0145蛋白为分泌蛋白，相对于野生型牛支原体，该菌株呈现出黏附能力降低，诱导细胞因子IL-8水平显著减弱，可望作为减毒株在牛支原体免疫防控领域中发挥作用。

为了实现上述目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室从牛支原体突变体库中筛选得到一株MbovP0145突变株，此突变株表达MbovP0145蛋白缺陷，该蛋白为牛支原体强、弱菌株差异表达，推测与毒力相关。经验证，在牛支原体与宿主细胞互作过程中，该突变菌株黏附能力和诱导细胞因子IL-8的能力显著降低。在PPLO培养基中，该突变株与野生株生长曲线无显著差别。黏附和诱导细胞因子分泌是牛支原体实现感染的重要指标，也是与毒力相关的生物学特性。因此，牛支原体MbovP0145突变株可作为牛支原体毒力减弱菌株，对开发牛支原体安全有效的疫苗具有重要的应用价值。

更加具体的技术方案如下：