[发明专利]一种抗新型冠状病毒S蛋白的CAR-T细胞、制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种抗新型冠状病毒S蛋白的CAR‑T细胞，所述CAR‑T细胞，经抗新型冠状病毒S蛋白优化的单链抗体基因修饰，所述优化的单链抗体为序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸；所述新型冠状病毒为COVID‑19；本发明还提供上述CAR‑T细胞的制备方法和应用。本发明提供一种免疫细胞疗法CAR‑T技术，可以精准清除体内感染的COVID‑19病毒细胞，安全高效的治疗新型冠状病毒，本发明构造的CAR‑T细胞杀伤效果显著，对表达COVID‑19病毒S蛋白抗原的细胞杀伤率高达90%以上；本发明首次利用单个B淋巴细胞克隆和筛选策略技术筛选出针对COVID‑19病毒的scFv（单链抗体）。

技术领域

本发明涉及一种抗新型冠状病毒S蛋白的CAR-T细胞、制备方法及其应用，属于属于生物医药技术领域。

背景技术

COVID-19病毒引起的肺炎一般症状表现为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者会出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍。基于目前的流行病学调查，该病的潜伏期1-14天，多为3-7天，潜伏期也具有传染性，危害极大。自流行病爆发以来，既有西药（α型干扰素、洛匹那韦、利托那韦）、中药（轻症）等多种疗法积极加入治疗的行列，又有精准医学和干细胞疗法等高科技疗法加入流行病的预防和控制。临床研究表明，对包括SARS-CoV-2在内的所有人类冠状病毒感染，除了对症治疗外，国内外尚没有治愈新冠病毒的靶向药物上市，也没有开发出成熟有效的疫苗。目前临床治疗方法主要是采用高效抗逆转录病毒药物和注射新冠患者康复者血浆疗法，这些疗法虽然也起到了一定的治疗作用，但对病人本身的机体副作用伤害也较大或者容易引起一些免疫反应，都达不到理想的治疗效果。康复期COVID-19患者的血清抗体对治疗危重的COVID-19患者有一定的疗效，因此研制抗COVID-19的抗体对于新型冠状病毒的特异性治疗具有重要意义。

冠状病毒是一种有包膜的、非节段的单股正链RNA球形病毒，直径为 120~160 nm（图1），分为α、β、γ 和 δ四个属，新型冠状病毒属于β属，病毒粒子的外周是整齐排列的纤突，被脂质膜所包裹，包括刺突糖蛋白(spikegly coprotein，S蛋白)、膜蛋白(membraneprotein，M蛋白)和包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)。其中，S蛋白（含有S1和S2两个亚基）是最重要的致病蛋白，最新研究表明，在COVID-19与SARS病毒S蛋白的保守性最高，其在结合细胞受体和介导病毒与宿主细胞膜的融合过程中起着重要作用，在COVID-19感染过程中是中和病毒感染的主要靶标。因此，选取COVID-19病毒的S蛋白为靶点，使用国际上最先进的CAR-T技术治疗COVID-19病毒，可以有效地阻断病毒侵入宿主细胞，清除体内的新型冠状病毒，达到彻底治愈的目的。

对于急重症患者，多采用抗病毒药物和注射新冠患者康复者血浆疗法治疗COVID-19患者，新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第七版)推荐抗病毒治疗可试用α-干扰素(广谱抗病毒药物)雾化吸入、洛匹那韦/利托那韦或可加用利巴韦林(广谱抗病毒药物)。对于轻症患者，可以结合中医疗法进行治疗。

抗病毒药物副作用大，患者易出现药物耐受。中药治疗效果缓慢，对于重症患者治疗效果差。这两种方法只能降低体内的病毒含量，无法彻底清除体内的COVID-19病毒。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种抗新型冠状病毒S蛋白的CAR-T细胞、制备方法及其应用，选取COVID-19病毒最保守的区域S蛋白为靶点，筛选出抗COVID-19病毒的特异性单链抗体，并进行密码子优化，得到抗COVID-19病毒的单链抗体，采用第三代CAR，使用COVID-19患者自体的外周血，体外进行基因编辑（将构建的CAR结构转入T细胞）之后，靶向治疗新型冠状病毒，无副作用，安全性高，治疗周期短，可以实现对新冠病毒感染的细胞的精准清除，杀伤效率高，从而抑制病毒在感染细胞内的复制。

本发明采取以下技术方案：