[发明专利]一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用

说明书

本发明为一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用，公开一种引起双孢蘑菇湿泡病的疣孢霉菌新种的快速检测方法及其在双孢蘑菇湿泡病早期诊断中的应用。具体公开了一种快速检测和鉴定疣孢霉菌新种的特异引物及检测方法，以样品DNA为模板，通过设计的一对鉴别疣孢霉菌新种的特异引物T‑7‑1F/AT‑3R进行PCR扩增，如果扩增出228bp的条带，则检测出疣孢霉菌新种，否则未检出。本发明提供的疣孢霉菌新种的检测引物和检测方法具有灵敏度高、简单快速、稳定性好、适用性广的特点。可以有效地从引起双孢蘑菇湿泡病的疣孢霉属中区分出新种，还能有效区分双孢蘑菇干泡病、软腐病等相似病害；且可用于双孢蘑菇湿泡病的早期诊断和新种的监测和鉴定。

技术领域

本发明涉及一种双孢蘑菇疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)的分子检测引物及应用；专用于疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)的快速、灵敏和特异性分子检测，同时可用于双孢蘑菇湿泡病的早期诊断和疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)的鉴定和监测。属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

双孢蘑菇又称白蘑菇，由于其口感好，兼具营养价值和药用价值，是一种重要的食药用菌。我国是世界上最大的双孢蘑菇生产国，2013年我国的双孢蘑菇产量达到全世界总产量的54％。随着我国双孢蘑菇栽培面积的增长和栽培方式多样化，病害问题逐步呈现，主要表现为：病害发生较为普遍，采用传统栽培方式的菇房管理不到位，病害严重发生；部分常见病害出现了加重趋势。其中由丛梗孢科(Moniliaceae)疣孢霉属(Mycogone)真菌引起的双孢蘑菇湿泡病已成为危害双孢蘑菇最主要的病害之一。对该病害的防治呈现两个特点：缺少具有抗病性的双孢蘑菇商业栽培品种；疣孢霉菌与其寄主双孢蘑菇同属真菌，杀菌剂对两者均有抑制作用，评价杀菌剂药效的同时还需考虑对双孢蘑菇的安全性，迄今登记用于防治双孢蘑菇湿泡病的杀菌剂较少。因而双孢蘑菇湿泡病的早期检测对预防该病害具有重要意义。

前期，我们大量研究了全国双孢蘑菇湿泡病的病原菌。结果表明，除菌盖疣孢霉和红丝疣孢霉外，还有一个新种同样造成我国双孢蘑菇湿泡病，并且该病原菌在我国上海、新疆等多个双孢蘑菇产区发生为害，我们将其命名为Mycogone huxienia，这是世界范围内首次发现。该病原菌对双孢蘑菇的致病力强，造成重大的质量和产量损失。但是，Mycogonehuxienia在形态学上与菌盖疣孢霉、红丝疣孢霉极其相似，造成的病害症状也相似。因此，利用传统的形态学方法难以区分和辨别疣孢霉属属下菌盖疣孢霉、红丝疣孢霉和Mycogonehuxienia，且工作量大，鉴定成本高，周期长，对经验的依赖程度高，且准确性低。通过形态学和多基因联合的系统发育分析方法，由于需要对多个基因进行测序，工作量更大，鉴定周期更长，实用性也较差，影响病原菌的诊断速度。

因此，发明一种快速准确的检测和鉴定方法尤为重要，不仅可有效快速地从引起双孢蘑菇湿泡病的各病原菌中检测和鉴定出Mycogone huxienia，而且这将对疣孢霉菌的分类、群体多样性及科学防治具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中根据形态学特征鉴定疣孢霉菌对经验依赖度高，程序繁琐，准确性低的问题，以及现有分子检测技术以ITS序列设计检测引物，造成因rDNA-ITS序列差异小，难以区分近缘种的技术缺陷，提供了一种基于Tef-1α基因的疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用。利用本发明所述的特异引物及检测方法可实现对疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)简便快速、灵敏准确的检测。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

1.疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)PCR特异性引物：

通过测定疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)、疣孢霉属其它种(Mycogone spp.)及双孢蘑菇其它病原菌的Tef-1α基因序列，对疣孢霉属不同种间及与双孢蘑菇其它病原菌间Tef-1α基因进行比对分析，设计筛选出对疣孢霉菌新种(Mycogone huxienia)具有特异性扩增作用的一对引物，其核苷酸序列为：