[发明专利]牛支原体免疫磁珠的制备方法

说明书

本发明公开了一种牛支原体P48基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一种牛支原体P48抗原蛋白，它是由所述的一种牛支原体P48基因表达的蛋白；一种抗牛支原体多克隆抗体，它是以上述的一种牛支原体P48抗原蛋白为抗原制备的多克隆抗体；一种抗牛支原体免疫磁珠的制备方法；结果表明，1）NHS磁性微球在偶联缓冲液为2‑吗啉乙磺酸（MES）、抗体浓度为200μg/mL时抗体的偶联效率最高；2）所制备免疫磁珠在15min之内能够富集到牛支原体，最低富集浓度分别为菌浓度为10^‑3CCU/mL，具有良好的特异性和灵敏性。

技术领域

本发明属于免疫磁珠制备技术领域，具体涉及牛支原体免疫磁珠的制备方法。

背景技术

牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）属于原核生物界（Prokaryotes），柔壁菌门（Periphyta）柔膜体纲（Choroids）支原体目（Mycoplasma）支原体科（Mycoplasmaceae），其在支原体属中属于致病性较强的物种之一我国在1983由黎济申首次报道从牛乳分离出牛支原体后，此后2008年，辛九庆等首次从患有牛肺炎的肺脏中分离得到该病原微生物。牛支原体能够引起牛的肺炎、乳腺炎、关节炎、生殖器官和角膜炎等疾病，其引发的疾病多发生于经长途运输的育肥架子牛，给我国畜牧养殖业造成了较严重的经济损失。

由于牛支原体为苛养菌，对其分离培样时，极为耗时，不利于临床的诊断和治疗。对于牛支原体的病原学诊断包括病原的分离鉴定，其可以作为权威的诊断方法。但是病原的分离鉴定方法极为严格且分离难度大，周期长，不适合作为快速诊断的牛支原体的方法，主要是因为将患病组织接种于固体培养基上，培养数天。牛支原体血清学检测主要测定是体内抗体的含量来进行诊断的，Ball等创建的夹心ELISA诊断技术，目前已经成为商品化的诊断技术。

对于病原微生物的分离检测来说，常规的方法对于一些病原微生物来说存在一定的难度，且耗时较长，但是免疫磁珠技术具有灵敏性高、快速和特异性好的优点，因此其能够快速的从复杂的背景中将病原微生物分离出来，提高对目标物的检出率，大大的缩短检测时间。这相对于常规的分离检测来说，免疫磁珠技术主要缩短了对病原菌的前期处理的时间。因此，在国内外有许多学者都利用免疫磁珠应用于病原微生物的分离。

免疫磁珠不仅能应用于细胞和病原微生物领域，还有其他领域：核酸的分离纯化、蛋白质的分离纯化、靶向药物等领域。除此之外免疫磁珠技术还能与其他技术结合能够提高检测效率和检测限：免疫磁珠技术和PCR技术、电化学技术、ATP生物发光技术，ELISA技术等。而利用免疫磁珠对蛋白质的分离纯化则是因为免疫磁珠具有比表面积大，偶联容量大的特点，且能够与目标蛋白质发生可逆行的结合。与常规的蛋白质分离机相比较而言，其具有简便、蛋白损耗少的特点。

发明内容

本发明目的是为解决牛支原体检测时间长、检出率低的问题，而提供牛支原体免疫磁珠的制备方法。

一种牛支原体P48基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

一种牛支原体P48抗原蛋白，它是由上述的一种牛支原体P48基因表达的蛋白。

一种抗牛支原体多克隆抗体，它是以上述的一种牛支原体P48抗原蛋白为抗原制备的多克隆抗体。

一种抗牛支原体免疫磁珠的制备方法，它包括：

1）蛋白溶液的配制:取上述的抗牛支原体多克隆抗体用MES缓冲液溶解，配成浓度为1mg/mL的蛋白溶液；将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用；

2）取50 μL磁珠于1.5 mL离心管中；

3）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；