[发明专利]一种牛血红蛋白制品中牛源基因组DNA定量检测方法及其应用

权利要求书

1.一种牛源血红蛋白制品中牛基因组DNA的荧光定量PCR检测方法，其包括：

对所述牛源血红蛋白制品中的DNA进行提取，和

利用荧光定量PCR方法对提取的DNA进行扩增检测；

其中：

所述提取包括如下步骤：

1)每取250μL所述牛源血红蛋白制品至2mL离心管中，加入20μL Proteinase K溶液和300μL裂解液GHL，振荡混匀，75℃裂解15min，期间颠倒混匀3回，每回5次；

2)向步骤1)获得的产物中加入300μL异丙醇，振荡混匀10sec，加入15μL磁珠悬浮液GH，振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min；之后将所述2mL离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

3)向步骤2)获得的产物中加入900μL缓冲液GDZ，振荡混匀2min；之后将所述2mL离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

4)向步骤3)获得的产物中加入500μL缓冲液GDZ，振荡混匀2min；之后将所述2mL离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

5)将所述2mL离心管从磁力架上取下，加入250μL漂洗液，振荡混匀2min；之后将所述2mL离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

6)将所述2mL离心管从磁力架上取下，加入250μL漂洗液，振荡混匀2min；之后将所述2mL离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

7)将所述2mL离心管放置于磁力架上，室温晾干10-15min，之后将所述2mL离心管从磁力架上取下，加入50-100μL洗脱缓冲液TB，振荡混匀，置于56℃温度下孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次；

8)将所述2mL离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移至一个新离心管中，获得了DNA提取液；

所述牛源血红蛋白制品的体积至少为2mL，

所述漂洗液的组成为：100mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl pH7.5，80％乙醇，0.4％-0.6％Triton X-100，

所述Proteinase K溶液、裂解液GHL、磁珠悬浮液GH、缓冲液GDZ和洗脱缓冲液TB来自天根生化科技(北京)有限公司DP705-1磁珠试剂盒；

所述荧光定量PCR方法中：

扩增使用的上游引物Bos-ACTB-1F2的序列为：5′-TTCTGAAGTGAACCTCATTCTGGG-3’(SEQID NO：11)，下游引物Bos-ACTB-1R2的序列为5′-CACCACAAGGGGCAGTCG-3’(SEQ ID NO：12)，探针Bos-ACTB-P1的序列为：5’-CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-3’(SEQ ID NO：3)；

其中：

所述牛源血红蛋白制品是通过下述方法制备的:

1)使用含有抗凝剂的无菌容器收集牛血；

2)所述收集牛血结束后用超滤法洗涤所述牛血；

3)通过离心法或膜过滤法对所述洗涤后的所述牛血进行细胞分离，获得牛血红细胞，

裂解所述牛血红细胞，获得血红蛋白溶液；

或者，通过溶出法对所述洗涤后的所述牛血进行血红蛋白溶出处理，获得血红蛋白溶液；

4)对所述血红蛋白溶液进行除氧，获得脱氧血红蛋白溶液，从而稳定所述血红蛋白溶液；

5)纯化所述脱氧血红蛋白溶液，从而减少非特异性血细胞成分，其中所述纯化是通过色谱法实现的；

6)通过30,000Da中空纤维膜超滤所述纯化后的所述脱氧血红蛋白溶液，达到所需的血红蛋白浓度，从而稳定所述纯化后的所述脱氧血红蛋白溶液；

7)将步骤6)获得的脱氧纯化血红蛋白溶液通过30,000Da中空纤维膜超滤，并用储存缓冲液进行渗滤换液，所述储存缓冲液中十二水合磷酸三钠的浓度为2.63g/L，七水合磷酸氢二钠的浓度为7.0g/L，乙酰半胱氨酸的浓度为2.0g/L；

8)将步骤7)获得的脱氧纯化血红蛋白溶液与戊二醛进行交联聚合；

9)用硼氢化钠还原步骤8)获得的聚合纯化的脱氧血红蛋白；

10)通过对步骤9)获得的聚合纯化的脱氧血红蛋白进行透析滤过，使所述聚合纯化的脱氧血红蛋白稳定下来，获得聚合血红蛋白溶液；

11)过滤步骤10)获得的聚合血红蛋白溶液，获得最终聚合血红蛋白溶液；

12)用柔性袋或西林瓶灌装所述最终聚合血红蛋白溶液，获得所述牛源血红蛋白制品。